超高效液相色譜-串聯質譜法分析柑橘及土壤中苦參堿殘留

沈沛霖，錢 圓，衛嚴冰，王蒙岑，朱國念

(浙江大學 農藥與環境毒理研究所，浙江 杭州 310058)

苦參堿是從苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)、苦參(SophoraflavescensAit)、廣豆根(SophorasubprostrataChun et T.Chen)、山豆根(SophoratongkinensisGapnep)等槐屬植物的根、莖中提取得到的水溶性總堿，是多種生物堿的總稱，具有較為廣泛的醫用和農用活性[1]。

苦參堿純品為白色粉末，相對密度1.16，熔點77 ℃，分子式為C15H24N2O，其相對分子質量為248.37。苦參堿屬于天然植物源農藥，對人畜低毒，是廣譜殺蟲劑，兼具觸殺和胃毒作用，其殺蟲機理是使害蟲神經中樞麻痹，從而導致蟲體蛋白質凝固、氣孔堵塞，最后窒息而死。此外，在持效期內，苦參堿還具有趨避作用，可有效減少害蟲對作物的危害。由于苦參堿作用于害蟲神經中樞，故其后代產生抗藥性的可能性大大降低[2]，對各種作物上的菜青蟲、茶小綠葉蟬、紅蜘蛛、茶尺蠖、小菜蛾等害蟲有明顯的防治效果[3-5]。同時，苦參堿兼具殺菌抑菌作用，對炭疽病、赤霉病、疫霉病、灰霉病的病原菌也具有一定的抑制作用[6-8]。

近年來，苦參堿在柑橘園中大量應用，而且在未來的應用也會更為廣泛。目前，國內外雖有部分學者對苦參堿的殘留分析方法進行了報道，但多采用傳統的色譜法進行分析檢測，靈敏度和準確度相對較低。因此，筆者利用超高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法(UPLC-ESI-MS/MS)建立了一套快速、靈敏、可靠的殘留分析方法以檢測柑橘及土壤樣品中的苦參堿殘留，為苦參堿的生態及膳食風險評估提供了有效的分析方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試柑橘品種為南豐密橘，柑橘和土壤樣品均采自江西省南昌市江西農大柑橘生態園，土壤類型為黃紅壤，pH值為6.0。苦參堿標準品(純度98.0%，大連美侖生物技術有限公司)。

超高效液相色譜-質譜聯用儀UPLC-ESI-MS/MS (Waters)；色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 m×100 mm，1.8 μm)；高速勻漿機、高速離心機、旋轉蒸發儀(RE-2000)、N-EVAP 11氮吹儀(杭州爾力公司)。流動相乙腈、甲酸為色譜純；硫酸鎂、氯化鈉、無水硫酸鈉、PSA、乙酸乙酯、甲酸等試劑均為分析純。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品的提取與凈化

QuEChERS法提取。土壤、橘肉、橘皮、全果：稱取制備好的樣品20 g于250 mL離心瓶中(橘皮和全果樣品加入20 mL去離子水)，加入50 mL乙腈，勻漿2 min，225 r·min-1振蕩30 min，過濾至裝有6 g NaCl、8 g MgSO4·7H2O的具塞量筒，劇烈振蕩1 min，靜置30 min，吸取40 mL上層溶液于梨形瓶中，濃縮近干，氮氣吹干，待凈化。

PSA凈化。向上述梨形瓶中加入2 mL色譜乙腈定容，轉移至裝有100 mg PSA和200 mg無水硫酸鎂的離心管中，渦旋凈化1 min，在超高速離心機中以10 000 r·min-1離心3 min，過0.22 μm有機膜，UPLC-MS/MS待測。

1.2.2 UPLC-MS/MS分析條件

樣品采用超高效液相色譜串聯質譜法檢測，UPLC采用梯度洗脫。具體過程為：0～1.5 min，流速0.30 mL·min-1，乙腈-0.1%甲酸水(2/98，V/V)；1.5～2.0 min，流速0.30 mL·min-1，乙腈-0.1%甲酸水(70/30，V/V)；2.0～4.0 min，流速0.30 mL·min-1，乙腈-0.1%甲酸水(80/20，V/V)。

柱溫40 ℃，流速0.30 mL·min-1，進樣量5 μL。質譜采用ESI(電噴霧離子源)正源多重反應監測(MRM)模式，毛細管電壓3.0 KV，錐孔電壓30 V，離子源溫度120 ℃，脫劑溫度350 ℃，脫溶劑氣流量650 L·h-1，錐孔氣流量50 L·h-1。苦參堿保留時間為2.64 min，定性離子對(m/z)250.07/149.61，定量離子對(m/z)250.07/149.61和250.07/177.73；滯留時間0.2 s，碰撞能量35 eV

1.2.3 標準曲線的繪制

將1.0 mg·mL-1的苦參堿標準溶液用乙腈稀釋配得0.1、0.2、0.5、1、2 mg·L-1系列標準溶液，再用空白樣品提取液稀釋成濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2 mg·L-1的標準工作液在上述UPLC-MS/MS條件下進行測定，采用外標法定量，以進樣濃度為X軸、響應值為Y軸得到標準工作曲線。

1.2.4 殘留計算公式

苦參堿殘留量(mg·kg-1)=[進樣樣品檢出量(mg)×定容體積(mL)]/[進樣量(mL)×樣品重量(kg)]

2 結果與分析

2.1 方法的靈敏度及標準曲線

在優化后的分析條件下進行測定，苦參堿的保留時間約為0.79 min，儀器的最小檢出量為5×10-12g。在0.1～2 mg·L-1范圍內的苦參堿的儀器響應值均與濃度呈良好線性關系(表1)。

表1 不同樣品的標準工作曲線

2.2 方法的準確度與精密度

取全果、橘肉、橘皮和土壤樣品(各20 g)，添加系列濃度的苦參堿標準溶液進行回收率試驗，每濃度處理重復5次(表2)。苦參堿在4種基質樣品中的平均回收率為77.7%～100.0%，說明方法的準確度和精密度均符合農藥殘留分析的要求。

表2 苦參堿在全果、橘肉、橘皮和土壤中的 平均添加回收率

3 小結與討論

目前，關于苦參堿殘留分析方法的研究報道較少，且多采用傳統色譜方法進行檢測分析。孫楊等[9]使用無水乙醇超聲提取黃瓜和土壤中的苦參堿，并使用氣相色譜分析方法表明，黃瓜和土壤中苦參堿的最小檢出量均為1.36×10-12g，最低檢出濃度為0.004 mg·kg-1(黃瓜)、0.008 mg·kg-1(土壤)。郝佳等[10]采用C18固相萃取-高效液相色譜分析方法，研究了苦參堿在小白菜及土壤中的殘留和消解動態表明，苦參堿在小白菜與土壤中的定量限(LOQ)均為0.02 mg·kg-1。陳紅平等[11]建立了茶葉中苦參堿殘留檢測的2種前處理方法，比較了液相色譜-串聯質譜與氣相色譜-串聯質譜檢測茶葉中苦參堿殘留量分析方法的適用性。楊方等[12]建立了液相色譜-串聯質譜同時檢測水產品中苦參堿與魚藤酮殘留的方法，其中苦參堿的檢出限為0.86 mg·kg-1。與之前報道的方法相比較，筆者所建立的方法利用QuEChERS法提取和N-丙基乙二胺(PSA)凈化，使前處理時間得到有效縮短，且凈化效果理想，同時結合UPLC-ESI-MS/MS檢測，使方法的靈敏度和準確度得到了一定的提高。

在質譜條件優化中，分別用正、負離子模式進行母離子全掃描，對比結果，得到正離子模式的響應較高，因此選擇正離子檢測模式。通過調節碰撞電壓發現苦參堿在碰撞電壓35 eV時碎片離子較少，且主要特征子離子碎片豐度達到最大，極大提高了目標的分析靈敏度。在流動相條件優化中，比較了乙腈、甲醇、水在不同組合和配比下對分離度的影響，結果表明，在乙腈-水體系中峰形尖銳對稱，同時在加入甲酸后，峰形更佳。因此，確定乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相。此外，對錐孔電壓等其他參數也進行了優化，并通過基質加標消除基質效應，使檢測條件達到最佳。

筆者利用UPLC-MS/MS建立了一套柑橘中苦參堿殘留的分析方法，并通過簡化前處理步驟，優化檢測條件等方法提高了操作的簡便性和檢測的靈敏度。添加回收率試驗結果也表明，該方法符合殘留檢測的分析要求。綜上所述，所建立的分析方法能夠用于有效檢測柑橘及土壤中苦參堿的痕量殘留，為進一步的生態和膳食風險評估提供了重要的方法依據。

[1] 曹美愛. 苦參化學成分及生物活性研究[D]. 蘭州：蘭州大學，2007.

[2] 熊鑫. 苦參堿對番茄生長發育的影響[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2015.

[3] 王玉龍，關扎根，賈學思，等. 苦參堿在農業害蟲防治中的應用研究進展[J]. 山西農業科學，2012(4)：424-428.

[4] 吳傳萬，杜小鳳，王偉中，等. 苦豆子總堿防治菜青蟲及對蔬菜品質的影響[J]. 江西農業學報，2005(3)：37-41.

[5] 文兆明，韋靜峰，彭有兵，等. 幾種植物源殺蟲劑防治茶小綠葉蟬效果比較試驗[J]. 中國農學通報，2008(1)：379-383.

[6] 蘇克躍，王云海，嚴寒，等. 苦參堿防治甘藍蚜蟲和茄子灰霉病的田間防效評價[J]. 中國植保導刊，2013(12)：66-67.

[7] 嚴清平，袁善奎，姜輝，等. 苦參生物堿對植物病原菌的離體抗菌活性研究[J]. 農藥科學與管理，2007(12)：46-49.

[8] 袁靜，關麗杰，叢斌，等. 苦參生物堿抑菌生物活性測定[J]. 農藥，2005(2)：86-89.

[9] 孫揚，徐應明，秦冬梅，等. 苦參堿在黃瓜和土壤中的檢測方法及其殘留動態研究[J]. 農業環境科學學報，2010(4)：686-691.

[10] 郝佳，吳志鳳，邱曉鵬，等. 高效液相色譜法檢測苦參堿在小白菜及土壤中的殘留與消解動態[J]. 農藥學學報，2016(3)：367-372.

[11] 陳紅平，劉新，汪慶華，等. 液相色譜-串聯質譜法與氣相色譜-串聯質譜法測定茶葉中苦參堿殘留量[J]. 分析測試學報，2010(12)：1162-1167.

[12] 楊方，鄭丹萍，劉正才，等. 液相色譜-串聯質譜法同時檢測水產品中苦參堿和魚藤酮殘留[J]. 分析化學，2011(4)：556-559.