芪苓益肝顆粒在慢性肝病中JAK-STAT信號通路介導的分子作用機制研究

胡 娜 王 靜

1.山西省中醫院肝病科 (山西 太原， 030012) 2.山東省威海市榮成市崖西中心衛生院

芪苓益肝顆粒由黃芪、茯苓、丹參、甘草等中藥組成，有健脾益氣、疏肝活血等功效，臨床用于治療慢性肝病療效顯著[1～3]。但由于中藥成分的多樣性和作用機制的多靶點、多通路，目前對于芪苓益肝顆粒的主要活性成分和潛在的分子作用機制研究較少。網絡藥理學是基于網絡觀點從系統水平分析藥物作用機制，闡明分子-靶點-疾病之間的相互關系，其與中藥整體調控機體的理念相吻合[4,5]。JAK-STAT信號通路是近年發現的一條由細胞因子刺激的信號轉導通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等許多重要的生物學過程，與諸多慢性肝病的發生發展密切相關[6,7]。筆者采用網絡藥理學方法[8]，研究芪苓益肝顆粒的主要活性成分和JAK-STAT信號通路介導的分子作用機制，為芪苓益肝顆粒治療慢性肝病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 芪苓益肝顆粒成分收集 從Universal Natural Products Database(UNPD，http://pkuxxj.pku.edu.cn/UNPD)中檢索黃芪、丹參、茯苓、甘草、茵陳蒿和澤瀉等六味藥材，得到967個小分子化合物，采用Open Babel[9](2.3.2 version，http://openbabel.org)軟件進行分子加氫后，選用MMFF94力場進行構象優化，優化時能量閾值設定為1×10-3J/mol。

圖1 藥材-分子-靶點網絡圖

1.2 分子對接 肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發展所共有的病理改變和必經途徑。關于肝纖維化發生的信號轉導通路研究已成為目前的熱點，其中Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT)信號通路是較新且近年來研究較多的一條，與肝纖維化形成過程密切相關[6]。因此，筆者利用分子對接方法對JAK-STAT信號通路靶點進行篩選。通過Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG，http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)中檢索，確定與上述疾病密切相關的21個作用靶點，刪除蛋白復合物中的水分子、配體、金屬離子或輔因子等。利用Auto Dock[10](4.0 version，http://autodock.scripps.edu)軟件完成分子對接工作，以靶點蛋白中原配體分子的坐標為盒子的中心，將格子的大小設置為 X，Y，Z：40，40，40?，格點間距為0.375?，每次對接產生100個構象，其余參數設為默認。

1.3 藥物-靶點及靶點-通路網絡構建與特征 本研究以靶點蛋白復合物中配體的對接打分為閾值，打分高于該閾值的化合物即認為具有活性[11]。從分子對接結果中選取對接打分較高的分子-靶點蛋白數據，并將網絡中小分子投射到相應的藥材，獲取藥材-分子-靶點數據并導入Cytoscape[12](3.1 version，http://www.cytoscape.org)網絡分析軟件，構建herb-compound-target (H-C-T)網絡。利用軟件Network Analyzer模塊[13]對H-C-T進行分析，觀察芪苓益肝顆粒中化合物與靶點的該計量方法作用情況。

2 結果

2.1 藥材-分子-靶點網絡構建與分析 從分子對接結果中獲取636組對接打分較高(score≥6)的分子-靶點蛋白數據，其中包含326個分子及21個靶點蛋白，平均1個分子靶向12.48個靶點蛋白，1個蛋白與30.53個分子發生作用，顯示了芪苓益肝顆粒的多成分、多靶點相互作用的特點。將藥材-分子-靶點數據導入Cytoscape網絡分析軟件，構建芪苓益肝顆粒H-C-T網絡見圖1，用network analyzer插件分析后得到整體網絡特征：網絡節點(Node)數目為347，網絡中心度(Network Centralization)為0.248，網絡密度(Network density)為0.011，最短路徑數(Shortest paths)為120062。在生物網絡中，度(degree)和介數(betweenness)能刻畫各節點在網絡中的重要程度，H-C-T網絡中部分重要節點的網絡特征值見表1和表2。

從化合物網絡特征來看，在326個活性分子中，節點網絡度大于2的有156個化合物，部分化合物的網絡特征如表1所示。節點網絡度大于5的化合物主要分布在甘草(12個)、澤瀉(3個)和丹參(1個)。節點網絡度最高的為Glabrolid(UNPD125061)，共作用于8個靶點蛋白，對接平均得分為6.791。Glabrolid是一種三萜類化合物，這類化合物多具有抗炎及保肝作用[14]。節點網絡度較高的Xambioona是一種黃酮類化合物，而甘草中黃酮類化合物多具有抗病毒、抗氧化和保肝等藥理作用[15]。有研究表明Xambioona可以靶向糖皮質激素受體，通過增加人體對外部刺激的適應能力和增強機體的抵抗能力來達到解毒效果[16]。此外，甘草中節點網絡度較高的化合物，如Glyuranolide、Isoglabrolid、21α-Hydroxyisoglabrolide和Liquiriticacid等化合物也多屬于三萜類化合物，推斷三萜類在慢性肝病中JAK-STAT信號通路介導發揮了較為重要的作用。

從靶點蛋白的網絡特征來看，在21個相關的潛在靶點中，節點網絡度大于10的有15個靶點蛋白表2，它們在JAK-STAT信號通路中的關系如圖2所示。JAK是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶(PTK)，它既能催化與之相連的細胞因子受體發生酪氨酸磷酸化，又能磷酸化多種含特定SH2區的信號分子從而使其激活[17]。JAK蛋白家族共包括4個成員：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它們平均作用于46.5個化合物，因而推斷芪苓益肝顆粒通過抑制JAK的磷酸化功能，對細胞因子的轉導過程產生影響。CBP/P300為組蛋白乙酰轉移酶,具有內在乙酰轉移酶活性，通過介導多種轉錄因子，對細胞的增殖和分化發揮非常重要的作用。PIM1和BCL2L1都具有凋亡抑制作用[18,19]，抑制它們的活性，會促進細胞周期的進展和有絲分裂，可能是慢性肝病后修復的重要機制之一。

表1 C-T網絡中部分化合物的網絡特征比較

表2 C-T網絡中部分靶點的網絡特征比較

3 討論

筆者通過網絡藥理學方法構建了藥物-靶標網絡，藥物-靶標網絡分析發現芪苓益肝顆粒中含有較多的三萜類化合物和黃酮類化合物，這些化合物具有抗炎、抗病毒、抗氧化、保肝和增強機體的免疫功能等藥理作用，同時芪苓益肝顆粒中的化合物可以和JAK-STAT信號通路中多個重要靶點發生作用，調節細胞的增殖和分化，促進細胞周期的進展和有絲分裂等環節，而這可能是芪苓益肝顆粒治療慢性肝病的主要機制。本研究通過網絡藥理學方法，從分子水平上揭示了芪苓益肝顆粒的主要活性成分和潛在的分子作用機制，為該品種的藥效物質基礎研究、質量控制提升以及作用機制的探索提供理論依據。這種將分子計算、網絡分析、文本挖掘等方法組合，將為中藥的藥效物質基礎分析、作用機理研究提供一種新的研究策略。