不同寬葉藍靛果種群遺傳多樣性的ISSR分析

張巍，孟慶彬，郭興，李金禹

0 引言

寬葉藍靛果忍冬（Lonicera edulis var.turczaninowii（Pojark.））為忍冬科忍冬屬植物［1］。筆者于2010年開始對小興安嶺伊春林區的寬葉藍靛果種源進行調查［2-3］，共確定三處野生分布。三個種源地均為伊春林區海拔較高地區，平均海拔分布高度約為550～1 400m左右［3-5］。為揭示寬葉藍靛果不同種源間的遺傳差異，運用ISSR-PCR分子標記分析方法對高海拔地區寬葉藍靛果各野生分布種群的遺傳多樣性水平和遺傳距離進行標記分析，希望可以為寬葉藍靛果不同種源的綜合評價及利用提供參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試樣本

所用供試藍靛果分別來自帶嶺大菁山、南岔黃花山、桃山平頂山三個種源地。其中，帶嶺大菁山選取2個種源地，每個種源各采集10個樣本，南岔黃花山選取1個種源地共采集10個樣本，桃山平頂山選擇2個種源地各采集6個樣本。樣本收集后馬上置于-20℃低溫保存。各樣本的名稱和采集地參見表1。

表1 供試樣本及采集地Tab.1 Sample and collection site

1.2 引物篩選

試驗用引物編號及其核酸序列（上海生工生物工程公司，Sangon）見表2。

表2 供試引物Tab.2 Test primers

1.3 藍靛果總DNA提取

試驗參考霍俊偉等的試驗方法［6-10］。采用CTAB提取寬葉藍靛果葉片總DNA，從上清液中獲取的DNA得率高，DNA電泳條帶清晰［11-12］。

1.4 ISSR-PCR

反應體系為20 μL，包括1×Buffer，2.0 mmol/L MgCl2，引物1.5 ng/μL，dNTP的濃度為0.2 mmol/L，TaqDNA聚合酶的用量為1U，模板DNA的用量為20～40 ng，TaqDNA聚合酶、引物、dNTP由上海生工生物工程（Sangon）公司提供。

PCR反應程序為：94℃變性4 min，94℃變性1 min ，36℃退火 40s，72℃延伸1 min，40個循環；72℃延伸8 min；4℃保存。

1.5 電泳檢測及數據處理

PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠于不超過5 V/cm的電壓下電泳，電極緩沖液為1×TAE，在含有0.5 ug/mlEB中染色30 min，凝膠成像系統拍照記錄。將瓊脂糖凝膠上出現DNA片段的計為1，不出現的為0，各數據計算公式如下：

（1）遺傳相似系數（genetic similarity，GS）公式［6］：

式中：Nij為基因型間共有帶數目；Ni和Nj為兩基因型各自的條帶數目。

（2）遺傳距離（genetic distance，GD）公式：

（3）有效等位基因數公式:

式中：fi2為第i個等位基因的頻率。

（4）Nei’s基因多樣性指數He（Nei，1978）［11-13］

式中：Pi為單個位點上的等位基因的頻率。

（5）Nei’s標準遺傳指數公式［8］：

式中：Nxy為材料X、Y公共帶數；Nx為材料X的帶數；Ny為材料Y的帶數。

以上數據經統計后輸入電腦，用NTSYS聚類分析軟件進行UPGMA法聚類分析并構建聚類圖譜。

2 結果與分析

2.1 種源間的ISSR多態性分析

某個位點有兩個以上等位基因，該位點就稱為多態性位點。多態性位點占同工酶分析的總位點數的百分比即為多態性位點百分率［8-10］。對采自不同海拔區域野生群落的42個寬葉藍靛果單株進行分子標記分析。結果表明，試驗所選用的10個引物所擴增出的條帶穩定性及可重復性均表現顯著。試驗共擴增出68個條帶，特異性位點百分率54.41%，其中特異性條帶數37個，平均每個引物共產生3.7個特異性條帶（表3）。

表3 ISSR分析的10條引物及其擴增產物Tab.3 ISSR analysis of 10 primers and their amplification products

圖1 ISSR電泳圖譜（引物OPA-02）Fig.1 ISSR electrophoresis pattern (primer OPA-02)

圖2 ISSR電泳圖譜（引物OPF-08）Fig.2 ISSR electrophoresis pattern (primer OPF-08)

由表3可知，10個引物中，OPA-02引物擴增的條帶數最多（圖1），但多態位點比率相對較少。而OPB-08和OPF-08兩個引物多態位點比率均達到71.43%，表明上述兩個引物可以檢測到更為豐富的多態性（圖2）。同時，以上數據也表明，寬葉藍靛果種間在分子水平上的多態性是豐富的，這為今后藍靛果ISSR引物的定向開發奠定了基礎。

2.2 遺傳多態位點分析

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎，也是生物多樣性最重要的部分［11-13］。通過對大菁山、黃花山和平頂山三處種源地的遺傳多樣性進行統計分析表明，平頂山種源區遺傳豐富度最高，共檢測出遺傳多態性位點24個，多態性位點比率達到35.29%。而黃花山和大菁山兩處種源地檢測出的遺傳多態性位點同為19個，多態性位點比率同為27.94%（表4）。

表4 各種群多態位點統計Tab.4 Statistical analysis of polymorphic loci

從表4可知，不同種群的多態位點比率在16.18%～30.88%。通過對三個種源區劃的5個寬葉藍靛果天然群落的檢測表明，大菁山和黃花山的遺傳豐富度相近，平頂山遺傳豐富度相對較高。在本次試驗中，出現了同一種源區劃的兩個采集樣方多態位點比率相差較大的情況，這可能因為寬葉藍靛果種群受高海拔自然因子局限，導致不同樣區遺傳豐富度產生差異。

通過GPS定位測距表明，黃花山種源帶與大菁山種源帶地理位置直線距離為27 km，大菁山種源帶與平頂山種源帶的地理直線距離為53 km，而黃花山種源帶與平頂山種源帶地理直線距離為76.9 km。衛星地圖觀測，各種源地山系間均有天然地貌阻隔，獨立成峰未交集。伊春林區地處小興安嶺南坡的中心地帶，其群落構成、山脈走向、成土結構等均具有小興安嶺山脈的典型特征。三處種源地共同處于小興安嶺山脈，屬于同一地理區劃。經計算，親源關系也維持在0.83水平。但另一方面，三處種源地海拔高度有所差異，黃花山海拔高度600 m左右，為三個種源地最低。大菁山種源地海拔1 000 m左右，平頂山種源平均分布在海拔1 400m左右。在對不同海拔群落多樣性的調查表明，不同海拔寬葉藍靛果群落生物多樣性有明顯差異，而海拔1 000m為寬葉藍靛果林型過渡帶［4］。由此可見，不同群落的遺傳差異有可能是海拔高度差異、群落自身大小及地理距離差異共同作用的結果。

2.3 遺傳距離和親緣關系分析

Nei指數（H）、Shannon指數（I）和有效等位基因數（Ne）是衡量種源遺傳多樣性的重要參數［12-15］。以相似性系數公式（GS）對三處種源進行遺傳相似系數計算，結果表明，大菁山和黃花山兩處種源遺傳相似系數為0.27，遺傳距離為0.73，表明兩處種源親源關系較近。而平頂山與大菁山、黃花山種源地的遺傳系數均為0.5，表明平頂山種源區與其它兩處種源的親源關系較遠。用 Nei指數（H）對種群間遺傳距離進行測算表明，大菁山與黃花山種源的親源關系最近，其測算值為0.349，與平頂山親源關系最遠，其測算值為0.534。而黃花山與平頂山測算的遺傳指數為0.39。

表5 各種源多態性統計Tab.5 Various sources of polymorphism statistics

進行遺傳多樣性分析結果表明（表5），Shannon多態性總體處于0.124 5～0.234 7，總體平均值為0.170 3，其中平頂山多態性最為豐富。Nei指數總體分布于0.062 5～0.065 3，總體平均值為0.126 1。Nei指數測算得到的結果與Shannon指數所得到的測算結果基本一致。

對42個單株進行聚類分析并建立樹狀圖（圖3），結果表明各單株的遺傳距離總體分布在0.80～0.99。其中A4、A5單株，B7、B9單株，C9、C10單株及E3、E5單株等遺傳距離都達到了0.99，表明具有效高的親源關系，而D4、D5單株在此次分析中與其它單株的遺傳距離最遠。總體分析，各單株的遺傳距離分布基本與種源分布密切相關。其中，大菁山A和B兩處分布單株親源關系較為集中，達到0.92水平。而黃花山各單株組內相對集中，組間的遺傳距離與大菁山更為接近，這也與之前筆者對各種源進行遺傳系數測算的結果一致。

3 結論與討論

（1）利用所篩選出來的10個引物運用ISSR分子標記手段對寬葉藍靛果不同海拔種源進行分析，共檢測到68個位點，多態位點比率在20%～71.43%。其中，平頂山群落多態位點比率最高為30.88，最低為16.18，表明組內遺傳差異較大。而大菁山和黃花山組內差異相對較小。

圖3 寬葉藍靛果42個品種聚類分析樹狀圖Fig.3 The broad leaf of Lonicera edulis 42 varieties of the dendrogram of cluster analysis

（2）通過本次檢測證明，寬葉藍靛果不同種源間存在一定差異性。其中大菁山與黃花山親源關系更為接近，而平頂山親源關系較遠。產生這一結果的原因可能與地理距離及海拔高度有關。

（3）對3個種源分布的遺傳距離進行測算表明，平頂山遺傳豐富度明顯高于其它種源，證明種群內基因流較強，種群總體處于活躍狀態。同時也證明寬葉藍靛果種群在長時間的進化過程中已經完成了對高海拔地區環境因子的適應。

［1］周以良, 董世林, 聶紹荃.黑龍江樹木志［M］.哈爾濱：黑龍江科學技術出版社, 1986.

［2］張巍, 王洪學, 王洪剛, 等.伊春林區藍靛果種質資源調查研究 ［J］.森林工程 , 2014, 30(1)：46-48.

［3］李紅莉, 龍作義, 逄宏揚.東北地區野生藍靛果忍冬果實形態變異研究［J］.安徽農業科學, 2014, 42(30) : 10705 -10707.

［4］張巍, 孟慶彬, 王洪剛, 等.寬葉藍靛果在不同海拔分布的生物多樣性分析［J］.森林工程, 2017, 33(3): 28-32.

［5］蘭士波.藍靛果忍冬生態耦合性分析與遺傳效應評價［J］.安徽農業科學, 2013, 41(33)：12843-1284.

［6］霍俊偉.藍靛果忍冬(Lonicera L.subsect.Caeruleae)生物學特性及種質資源的RADP研究 ［D］.哈爾濱：東北農業大學,2004.

［7］劉萬勃, 宋明, 劉富中, 等.RAPD和ISSR標記對甜瓜種質遺傳多樣性的研究［J］.農業生物技術學報, 2002, 10(3): 231-236.

［8］趙雷, 張繼蘭.云南松ISSR-PCR反應體系建立及優化［J］.北方園藝, 2012(12)：130-133.

［9］霍俊偉, 睢薇.藍果忍冬種間遺傳多樣性及親緣關系的ISSR研究 ［J］.吉林農業大學學報, 2009, 31(5)：516-520.

［10］孫岳, 李景鵬, 金元昌, 等.南、北五味子ISSR鑒別研究［J］.中醫藥學報, 2003, 31(1)：29-31.

［11］劉萬勃, 宋 明, 劉富中, 等.GAPD和ISSR標記對甜瓜種質遺傳多樣性的研究［J］.農業生物技術學報, 2002,10(3): 231-236.

［12］徐娜, 夏秀英, 徐大可, 等.越橘基因組DNA的快速提取及分析［J］.果樹學報2007, 24(5)：714-717.

［13］謝運海.東北地區水曲柳地理種源遺傳多樣性分析及優良種源選擇 ［D］.哈爾濱：東北林業大學, 2005.

［14］ 周延清, 楊清香, 張改娜.生物遺傳標記與應用 ［M］.北京,化學工業出版社, 2008.

［15］張巍, 王清君, 郭興.紅松不同種源的遺傳多樣性分析［J］.森林工程, 2017, 33(2): 17-21.

［16］顏承云, 楊治偉, 劉娟.黑龍江省藍靛果忍冬的資源調查［J］.中國野生植物資源, 2002, 21(2)：18-19.