腸道微生態對腫瘤免疫治療的影響

金 怡，鄭 怡，張航瑜，趙 鵬，涂曉璇，吳 偉，劉璐璐，方維佳

免疫系統是控制腫瘤的主導力量，免疫監視功能低下可導致腫瘤發生、發展[1]。近年來，腫瘤免疫治療開辟了腫瘤治療的新方向，然而除了微衛星高度不穩定患者外，獲益人群仍不明確。目前報道的程序性細胞死亡蛋白配體1（programmed cell death protein 1 ligand 1, PD-L1）的免疫組化表達和腫瘤突變負荷均無法明確預測免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）的療效[2]。有研究指出，腸道微生態參與了腫瘤的發生、發展，并影響腫瘤免疫治療效果。腸道菌群被認為是一個潛在的可預測腫瘤免疫治療效果的生物標志物，因此，調控腸道微生態也成為了免疫治療的一個部分。

1 腫瘤免疫治療的挑戰

目前腫瘤治療的重點已從靶向腫瘤細胞本身轉移到宿主的免疫系統。“腫瘤免疫周期”的正常運行是保證抗腫瘤免疫療效的前提[3]。腫瘤免疫逃逸在腫瘤發生、發展中發揮著關鍵作用[1]。T細胞介導的細胞免疫是參與腫瘤免疫治療的主要免疫反應，其發揮有效的抗腫瘤效應須將初始T細胞活化增殖和分化成效應T細胞[4]。近年來，ICIs在腫瘤免疫治療中取得了較好的進展。ICIs包括抗細胞毒性T淋巴細胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA-4）抗體、抗程序性細胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1,PD-1）抗體以及抗PD-L1抗體[5-6]。目前多種ICIs已經相繼被FDA批準用于治療黑色素瘤、非小細胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、頭頸鱗癌、消化系統腫瘤、泌尿生殖系統腫瘤等[7]。但免疫治療單藥療效只有20%左右。如何找到獲益的人群，如何擴大獲益的人群，成為腫瘤免疫治療面臨的新挑戰。

2 腸道微生態與腫瘤免疫治療

2.1 腸道微生態參與機體免疫調節 人類腸道微生物的數量龐大、種類繁多，被稱為人類的“第二基因組”，它不僅參與形成腸道局部免疫屏障[8]，還可誘導人類T細胞和B細胞活化[9-10]，使免疫系統識別和攻擊機會性細菌[11]，在多個層次上促進先天免疫和適應性免疫應答。有研究報道無菌小鼠在免疫方面存在嚴重缺陷，其體內NK細胞功能受損，單核吞噬細胞不能產生γ-干擾素[12]。腸道微生物對免疫系統的影響并不局限于腸內，在腸外諸多自身免疫疾病和慢性免疫疾病的病理發展中也都起著重要作用，甚至直接與患病機制有關[13-14]。

2.2 腸道微生態失調促進腫瘤形成 腸道微生態的改變可能通過幾種機制影響腫瘤發生、發展。第一，通過微生物或其代謝產物直接致癌。第二，破壞腸上皮的屏障功能，使免疫細胞接觸細菌內毒素和抗原。第三，細菌內毒素和抗原通過改變免疫細胞和促炎性因子刺激炎癥形成和免疫反應。第四，誘導DNA損傷和信號通路異常[15]。

2.3 腸道微生態變化可預測腫瘤發生 越來越多證據表明腫瘤的發生、發展與腸道微生態變化有關。Zitvogel等[16]的研究成果提示九大癌癥（急性淋巴細胞白血病、頭頸部鱗狀細胞癌、口腔癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膽管癌、人類乳頭瘤病毒相關性宮頸癌、尿路上皮癌）均與特定的腸道微生態組成及豐度表達相關。Dai等[17]對來自5個國家的526例糞便標本進行宏基因組分析，發現結直腸癌患者腸道內富集脆弱擬桿菌、具核梭桿菌等7種細菌，另有62種細菌減少。這些潛在的診斷性細菌標志物可用于結直腸癌無創性診斷。

3 腸道微生態調控腫瘤免疫治療的機制研究

3.1 有益腸道菌群可增強腫瘤免疫治療效果

3.1.1 基礎研究 2015年11月，《科學》雜志發表了2篇文章，首次將腸道微生態與ICIs療效聯系起來。美國團隊發現抗PD-L1單抗治療在基因相似的Jackson Laboratory （JAX）小鼠中比在Taconic Farms（TAC）小鼠中更有效，原因在于腫瘤特異性T細胞應答在JAX小鼠中顯著高于TAC小鼠[18]。而雙歧桿菌通過增強樹突狀細胞（dendritic cell, DC）的活化，提高TAC小鼠抗腫瘤作用。DC是目前發現的功能最強的抗原提呈細胞，它在抗腫瘤免疫應答中發揮關鍵作用[19]。法國團隊研究表明抗CTLA-4單抗不能抑制無菌小鼠或抗生素治療小鼠中的腫瘤生長[20]。而類擬桿菌、脆弱擬桿菌和洋蔥伯克氏菌可增加Th1免疫應答，促進瘤內DC的成熟，恢復小鼠對CTLA-4單抗的抗癌反應[20]。因此，通過糞菌移植（fecal microbiota transplantation,FMT）或口服上述菌群，可消除以上治療差異。

2017年，Uribe-Herranz等[21]研究發現過繼性T細胞治療（adoptive T cell therapy, ACT）的功效也受腸道微生態組成、抗生素治療以及FMT的影響。腸內富集多種擬桿菌有助于控制Harlan小鼠腫瘤生長。萬古霉素通過增加血清CD8α+DC和IL-12的數量，可提高JAX小鼠對ACT治療的反應。同年，法國Gustave Roussy癌癥中心研究團隊對接受來自ICIs治療無反應患者糞便移植的小鼠，通過口服補充Akkermansia muciniphila，增加腫瘤床募集CCR9+CXCR3+CD4+T細胞，增加CD4/Foxp3比例，誘導DC分泌IL-12，恢復小鼠對PD-1阻斷的反應[22]。

3.1.2 臨床研究 一項來自法國Gustave Roussy癌癥中心的研究對接受過ICIs治療的249例患者進行分析，發現Akkermansia muciniphila普遍存在于對ICIs治療反應良好的患者體內，而使用氨芐青霉素+黏菌素+鏈霉素的患者無進展生存期和中位總生存期皆短于前者[22]。2組患者的無進展生存期分別為4.1個月和3.5個月（P=0.007），中位總生存期分別為20.6個月和11.5個月（P＜0.001）。美國安德森癌癥中心前瞻性地收集并分享轉移性黑色素瘤患者微生物樣本，發現抗PD-1單抗治療后有效患者的菌群多樣性顯著高于無效患者[23]。有效患者體內富含糞桿菌、梭菌和疣微菌，有較高豐度的CD4+T和CD8+T細胞以及抗原加工和呈遞的標志物。無效患者體內則富含擬桿菌目、大腸桿菌等，有較高豐度的調節性T細胞（regulatory T cells, Tregs）和骨髓來源的抑制細胞（myeloidderived suppressor cells, MDSCs）。Tregs是一類控制自身免疫反應性的T細胞亞群，可抑制CD8+T細胞、NK細胞、B細胞和抗原提呈細胞等多種免疫活性細胞[24]。MDSCs是骨髓來源的一群異質性細胞，可促進Tregs細胞擴增，誘導PD-L1分子表達，抑制抗原提呈[25]。

Matson等[26]在16例抗PD-1單抗治療轉移性黑色素瘤有效患者中檢測出包括青春雙歧桿菌、乳酸桿菌和長雙歧桿菌等在內的8種高豐度菌種物種。無效患者只有2種高豐度細菌：瘤胃球菌和Roseburia intestinalis。青春雙歧桿菌可導致外周衍生的Tregs減少。且該研究認為有益菌群/無益菌群＞1.5有更好的免疫治療效果。Chaput等[27]發現在伊匹木單抗治療的黑色素瘤中，基線富含糞桿菌等厚壁菌門的腸道微生物群（A群）可預測更好的臨床反應。與基線富含擬桿菌屬（B群）的患者相比，A群患者有更長的無進展生存期（P=0.0039）。A群患者中CD4+T細胞及誘導型T細胞協同刺激因子（inducible T cell costimulator,ICOS）明顯增加，血清中可溶性炎癥標志物sCD25增加。其中ICOS被認為是伊匹木單抗療效的生物標志物[28]，sCD25則與T細胞的主要生長因子IL-2浸潤有關。

3.2 有益腸道菌群可預測并改善腫瘤免疫治療不良反應 免疫相關性結腸炎是最常見的與抗CTLA-4單抗相關的不良反應。一項前瞻性臨床研究提示，擬桿菌和涉及多胺轉運、B族維生素生物合成的腸道菌群在未發生結腸炎的患者中更為豐富。根據這些信息構建了預測發生結腸炎風險的模型，其靈敏度為70%，特異度為83%[29]。Chaput等[27]的研究也發現未發生結腸炎的患者，基線時全身炎癥因子和擬桿菌比例較高。擬桿菌和Burkholderiales的混合物可改善抗生素處理小鼠中抗CTLA-4單抗誘導的亞臨床結腸炎和結腸炎癥評分[17]。故推測高豐度的擬桿菌可作為預測未發生免疫相關性結腸炎的標志物。目前抗CTLA-4單抗和抗PD-1單抗被批準聯合用于治療黑色素瘤，可增加有效率（50%～60%）和延長無進展生存期[30]。然而，聯合用藥有接近60%的3～5級不良事件，40%的患者因毒性而中斷治療[30]。因此，將檢測基線腸道菌群作為預測因子，用于鑒別聯合用藥與單藥治療的患者，以減少嚴重不良事件的發生。

綜上所述，動物實驗與臨床試驗研究得出了相似的結論：①腸道微生態組成差異決定機體免疫差異，從而決定腫瘤免疫治療差異。腸道微生態能預測腫瘤免疫治療效果，通過補充特定的有益腸道菌群及促使腸道微生態多樣化有助于獲得更高的有效率。②腸道微生態能預測并改善腫瘤免疫治療的不良反應。③多種抗生素可破壞ICIs抗腫瘤效應，但萬古霉素可增強ICIs療效。但上述研究得出的影響免疫治療的腸道菌群不盡相同，可能與瘤種、人種和所選藥物相關。此外，上述研究對腸道微生態改善腫瘤免疫治療效果的機制進行了簡單的探討。多樣化和高豐度的有益腸道菌群（如糞桿菌、疣微菌）可增強抗原遞呈介導的抗腫瘤免疫應答，并改善效應性T細胞功能及腫瘤微環境。相反，有害腸道微生物群（如大腸桿菌）使得抗原呈遞能力減弱而影響免疫治療效果[23]。

4 腸道微生態提高腫瘤免疫治療效果的開拓性研究

既往的免疫治療往往關注療效和毒副反應。隨著對腸道微生態的認識加深，腸道微生態的調控也將被納入免疫治療的全程管理中。有研究提出使用益生菌、益生元、合生元、抗生素或FMT與腫瘤免疫治療相結合，可以重新平衡腸道微生態[31]，本文僅重點討論FMT與抗生素的應用。

4.1 有益菌群的糞便移植 FMT是通過鼻胃管、鼻十二指腸鏡、內鏡、灌腸來實現。多個研究提示將腫瘤免疫治療有效的小鼠或患者的糞便移植到對腫瘤免疫治療無效的小鼠體內，可提高ICIs的療效[18，22]。富含 Akkermansia muciniphila[22]、雙歧桿菌[18]等有益菌種的糞便可用于FMT。除了衛生問題外，這種方法面臨的挑戰還包括選擇最佳捐助者和提供足夠的材料以使多名患者長期重復治療[32]。

4.2 抗生素的合理使用 從理論上講，抗生素可以用來減少腸道中有害菌群的豐度，同時為有益菌群創造棲息地。然而，如何使用抗生素仍值得商榷。流行病學研究表明，反復使用廣譜抗生素可致癌[33]。但實際上，包括多柔比星在內的蒽環類抗生素在化療中廣泛應用，這些抗生素可以誘導免疫原性細胞死亡，從而刺激抗癌免疫應答[34]。在腫瘤免疫治療中，抗生素的使用可降低腫瘤療效[20，22]，或增強療效[35]或不影響療效[36]。萬古霉素治療可增加CTLA-4抗體療效，廣譜抗生素則降低療效。使用萬古霉素可增加ACT的功效，但應用新霉素和甲硝唑時，ACT的功效沒有改變[21]。然而，萬古霉素對小鼠中環磷酰胺誘導的抗癌免疫應答則產生負面影響[37]。通過使用高選擇性的抗生素來殺滅或阻止有害細菌生長，這種方法應僅適用于逆轉對患者健康有危險時細菌的過度生長的情況[38]。在異基因造血干細胞移植過程中也傾向選擇窄譜抗生素[39]，這些藥物在移植后可能有助于最小化抗生素使用后某種程度上產生的細菌（例如粘液分解細菌：粘液螨）[40]。這表明抗生素介導的作用是依賴疾病背景的，可以是有利的也可以是有害的。因此，在腫瘤免疫治療中可行的策略是避免反復使用廣譜抗生素及利用特定抗生素的潛力。

5 問題與展望

部分有益菌群可作為生物標志物預測腫瘤免疫治療的效果，含有高豐度的雙歧桿菌、糞桿菌等有益菌的腫瘤患者可維持其免疫系統功能正常，為后續治療提供可能。此外，基于抗生素在其他腫瘤免疫治療中的負效應，在缺少足夠證據支持的情況下，目前認為在免疫治療前后，應避免使用抗生素。

當前，腸道微生態與腫瘤免疫治療的研究仍存在很多問題：①各研究中發現的有益菌群不盡相同；②抗生素參與免疫治療的增效/減效作用也不一致，抗生素使用時機、劑量、療程及種類尚不明確；③腸道微生態在腫瘤免疫治療中的機制尚有待進一步闡明；④目前研究的結論多來自動物實驗，因此需要更多前瞻性的臨床試驗驗證；⑤實現有益菌群改善ICIs治療反應的最佳方法仍有待確定。目前，保持身體健康或導致疾病相關的特定菌群的作用仍不清楚，可能是一組菌群而不是一個特定的菌種。為了獲得更好的腫瘤免疫治療效果，降低免疫治療毒性，期待開展更多的研究來鑒別腸道有益菌群，選出潛在治療有效的人群，提早發現可能無效甚至易出現超進展的患者。在此基礎上，進一步富集相應的“有益菌群”，更好地激活T細胞，或將成為提高腫瘤免疫治療效果的有效途徑。