高內涵篩選在分子機制研究中的應用

李廷躍 吳帆

暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院/廣州紅十字會醫院普通外科（廣州 510220）

高內涵篩選（high content screening，HCS）是一種以細胞為檢測對象，通過顯微成像法記錄多孔板內細胞的圖像并通過分析圖像中的信息來解析細胞內物質活動的技術工具［1］。該技術系在高通量篩選（high throughput screening，HTS）技術興起后逐步發展而來，主要依賴于高分辨率的細胞成像系統，充分整合樣品制備技術、自動化設備、數據管理系統、檢測試劑、生物信息學等資料的優勢，在細胞或分子水平上實現對細胞信號發送、信號傳導、信號接收及相關一系列反應的成像、分析及篩選［1］。HTS技術結果單一［2］，而HCS技術可在保持細胞結構和功能完整的條件下，同時監測被篩選藥品對細胞生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導等多個環境的影響，涉及膜受體、胞內成分、細胞器和離子通道等眾多靶點，從而能夠得到多方面的篩選結果［3］。由此可見，HCS技術可從單一實驗中獲得大量分子機制相關的信息，從而在近年來的分子機制研究中得到了廣泛應用。

1 實現小規模向大規模細胞生物學研究的飛躍

高內涵篩選未出現之前，運用熒光顯微技術進行細胞生物學研究仍處于小規模時期。所謂小規模細胞生物學的定義，即指運用顯微成像系統從較少數量的實驗樣品中收集圖像數據［4］。通常每份實驗樣品的細胞總數為10～1 000個。這些系統需要大量的人工操作以滿足以下4個條件：（1）維持最理想的光照；（2）試驗裝置和裝載細胞進入小的試驗環境；（3）集中掃描；（4）圖像采集、顯示、加工、分析。由于對手工或從圖像半自動數據析取的數據所產生的信息的處理是一個密集型勞動的過程，故想從這些實驗中產生新的知識，需要在數周甚至數月的時間里完成許許多多小規模實驗。這往往需要耗費大量的人力物力。再者，雖然這樣的小規模細胞生物學實驗有助于深刻理解細胞分子功能，但這些實驗的利用率很低，嚴重影響實驗研究的進展甚至限制實驗的繼續進行。而這樣的研究之所以只能在小規模范圍內完成，主要是因為以往的細胞生物學試驗尚未能實現自動化（如無法進行自動化分析設計、圖像采集、數據存儲等等）［5］。

但隨著高內涵篩選的出現，它將定量的熒光顯微技術施之于自動化的細胞生物學實驗，使得大規模細胞生物學研究成為可能。而且，在高內涵篩選的支持下，大規模細胞學實驗學已取得不少成就。高內涵篩選是一項研究多個細胞陣列中所包含的豐富的細胞生物學信息的自動化技術。其自動化過程涵蓋了實驗設計的關鍵環節、樣品制備、圖像采集、歸檔、處理、分析以及細胞信息發掘等多個過程，達到了真正意義上的“高內涵”?！案邇群奔粗讣毎诮Y構和功能完整的情況下，其生長分化等過程中的所有信息。

大規模生物學實驗同樣包括了若干變量的不同，比如細胞種類、基質的化學過程、競爭者或者對抗者的濃度、治療時間、每個實驗細胞參數的種類、時間點的計數和頻率等。在這些實驗中，通過使用完整細胞制成的高度相關的測量工具可以快速地分析其路徑。甚至，在群體里面的每個真實獨立的個體的多種細胞活動都可以被檢測到［6］。即活的細胞實驗所提供的機制學研究需要的細節完全不受影響，效果顯著。另外，通過這種大規模細胞生物學試驗，還可以快速地了解到，某個特定細胞過程中整個生物體水平的表型變化［7］。

高內涵篩選使大規模細胞生物學成為可能［4］，從而使得機制學的研究變得更加便捷，進而給予分子機制研究必要的條件及助力。如借助高內涵篩選可得到抑制或促進蛋白質表達的某些目的基因，進而達到實現研究分子機制的目標。其目標包括尋找到決定路徑的組件、決定給出的路徑所在的細胞生理過程的先后順序、證實治療方案的分子靶點等等。

2 HCS將分子機制研究帶入一個更深的研究層次

蛋白質組學和細胞組學研究依賴于分析生物化學事件中的分子視野。而這些分子視野的獲得則需要依賴先進的定量顯微技術，如熒光壽命成像顯微技術（fluores?cence lifetime imaging microscopy，FLIM）和福斯特共振能量轉移成像（forster resonance energy transfer imaging，FRE?TI）。分子水平檢測到的光譜信息，可用于估計細胞形態、分析細胞定位、識別分子或細胞亞群。由此，獲取特定環境下細胞對化學和物理刺激反應的分子機制成為可能，即自動化熒光壽命成像顯微設置的無人監管操作和成像分析可與這些技術所提供的高內涵相結合，進而對細胞反應的分子機制進行分析。

過去10年的研究已證明，FRETI和FLIM技術對單個細胞中生物化學狀態的定量成像起著重要作用。這些成像方法有助于對不同細胞總體進行分析。定量多參數顯微技術是一個非常年輕的領域。在該領域中，不斷進步的液態樣品處理機器人技術和信息技術正逐漸集成到自動化的顯微技術中，并通過自動化和無監督操作將高內涵圖像信息與高通量容量合二為一。

高內涵應用程序主要用來對影響細胞行為的物質或條件進行定量和多參數分析。舉例來講，對疾病分子機制的理解就需要高分辨率的信息，因為它篩選的目標是細胞和（或）亞細胞水平的。高內涵應用程序旨在監測分子路徑：如生物分子的定位、相互作用以及它們對藥物或病原體的反應等。無人監管的自動熒光壽命成像技術為可升級篩選平臺提供了基礎，使高通量水平和高內涵篩選得以合而為一，推動了分子機制研究朝更深層次邁進［8］。

3 HCS涉及廣闊的研究領域

3.1 HCS和細胞信號傳導 在藥物研發進程中，了解環境因素如何觸發特定的生物學瀑布式反應是治療控制的關鍵。因此，細胞信號轉導過程是篩選靶向藥物的主要來源。而借助HCS可以更好地理解新發現的蛋白質通過怎樣的途徑發揮作用［9］，進而為藥物研發提供方向和依據。

3.2 HCS和腫瘤學 HCS技術很早就被用于檢測細胞凋亡和增殖，從而使其在腫瘤研究中占據了一席之地。實際上，HCS技術對細胞周期，轉化和遷移的檢測中也具有重要作用。比如，通過改變HCS應用程序中的自動力試驗算法并采用相應的試劑盒，HCS便可用于評估腫瘤的轉移潛力，甚至觀察單個細胞的變化規律，有助于更好的理解抗腫瘤化合物如何與眾不同地影響癌細胞［10］以及檢測出腫瘤生物標記物的功能。

3.3 HCS和神經生物學 在HCS的早期發展中，人們意識到成像技術在神經元形態定量上具有較大的應用潛能，因此HCS技術最早被運用于監控神經突的增長。如今，HCS在各種各樣的神經疾病狀態的研究中應用非常廣泛。無論是對生物學的基礎研究、新模型的構建，抑或是用于干預治療的小分子的篩選，HCS都有著廣泛的應用，其應用實例包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮性側索硬化以及日益增多的腦癌研究等［11］。

3.4 HCS和體外毒性 從某種程度上來講，不論體外毒性是與周圍環境還是與化學因素有關，考慮到HCS技術觀察的是細胞對刺激的表型反應，因此所有HCS試驗均可被視為“毒性”試驗。從相對簡單的精確毒性測量，如細胞計數和細胞變圓，到更加特別的細胞健康的測量，HCS可以被應用于多種“毒性”研究中，尤其可在多重端點歸一化的多參數試驗中幫助定義微妙的毒性狀態［12］。

高內涵篩選在分子機制研究中涉及的種種領域以及其過程中所產生的思考和思路，直接或間接使得分子機制研究變得更為多樣化和全面化，同時也為分子機制研究提供了多重研究靈感及價值［13］。

4 高內涵篩選在肝癌靶向治療研究中的作用

4.1 背景 肝癌是嚴重威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一。根據全球癌癥狀況最新數據（Globocan 2012）的估計，肝癌已經位居全球惡性腫瘤死亡的第2位，2012年全球肝癌死亡病例約為74.6萬例，其中超過50%的肝癌死亡病例發生于我國［14］。盡管近年來肝癌手術切除率已明顯提高，肝癌的治療手段已趨于多樣化，但因臨床發現的肝癌仍以中晚期肝癌為主，這些患者發現時往往已無手術機會，但又缺乏有效的綜合治療手段，從而限制了肝癌整體治療水平的進一步提高［15］。近年來，以索拉菲尼為主要代表的分子靶向治療成為肝癌綜合治療領域中的重要進展［16］。但索拉菲尼往往在短期治療后即產生耐藥，且其耐藥機制目前尚不清楚，導致這一問題的原因可能就在于索拉菲尼本身發揮治療作用的分子機制目前尚不明確，由此可見，進一步篩選潛在的肝癌治療靶點并闡明其增殖凋亡作用機制，是提高肝癌靶向治療療效以及進一步提高肝癌整體治療水平的關鍵［17-18］。

4.2 應用 高內涵篩選借助高分辨率的細胞成像系統，充分整合樣品制備技術、自動化設備、數據管理系統、檢測試劑及生物信息學等方面的優勢，在細胞或分子水平上實現對細胞信號發送、信號傳導、信號接收及相關一系列反應的成像、分析及篩選，可以在短期內識別大量基因、蛋白的作用。相較于傳統的細胞遷徙篩選方法如侵襲小室侵襲和劃痕愈合試驗，HCS可直接在細胞芯片層面上對細胞行為進行調查研究，從而篩選出一個與肝癌有關的基因庫，而且識別出涉及肝癌增殖、轉移等生物學行為相關的基因：如LI等［19］近期采用高內涵篩選證實了AEG?1和AKRIC2這兩個在肝癌遠處轉移過程發揮重要作用的關鍵基因，從而為肝癌轉移的靶向治療研究提供了新的候選靶點。筆者最近也將高內涵篩選技術應用于肝癌潛在治療靶點Mus81基因的分子作用機制研究。筆者前期通過基因芯片得到了數百個與Mus81基因中可能相關的差異表達基因，接著通過生物信息學分析及高內涵篩選，從這數百個差異基因中篩選出數個與肝癌增殖相關的基因，并最終鑒定得到了Mus81的關鍵下游基因——STC2［20］，從而為針對Mus81基因進行肝癌靶向治療研究提供了新的理論依據。

4.3 其他 高內涵篩選加快了腫瘤學行為機制研究的速度［21］。它既可鑒定誘導腫瘤細胞生長過程中有絲分裂停止的小分子，也可篩選出候選的腫瘤抑制基因［22］，為了解腫瘤細胞癌變前的生理機制及相關抑制機制提供重要依據。同時，借助多參數的高內涵篩選平板、可視化數據和表型分類方法，可詳細地解釋個體復合效應和大量收集到的多個參數的細胞反應，從而為肝癌的靶向治療提供基礎。

綜上所述，HCS技術在分子機制研究中具有重要作用，其研究對象也已不再局限于小型生物分子，而是逐步擴大到蛋白質、小分子肽類等大分子。如分析Rab蛋白在高爾基前體退化的追蹤作用［23］、鑒定肝細胞內控制脂肪小滴形成和生長的小分子核糖核酸等［24］。隨著HCS技術的飛速發展及人們對該技術的不斷改進提高，如AMSBIO公司分析細胞侵襲的新型3D培養96孔基底膜提取板、Arte?mis公司的QS14熱電的冷卻CCD相機、Greiner Bio?One公司的96孔玻璃底微孔板等的開發［25］，因而可以想見，其在分子機制研究中的應用也將愈加豐富多彩。

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