人原代肝癌細胞培養方法現狀及展望

王杰欽 游輔宇 彭青 高毅

南方醫科大學珠江醫院肝膽二科，器官衰竭防治國家重點實驗室（廣州 510282）

原發性肝癌（primary liver cancer）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在全球所有惡性腫瘤相關死因中高居第二位［1］。原發性肝癌主要包括肝細胞癌（hepatocellular carci?noma）、肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma）和肝細胞癌-肝內膽管癌混合型3種不同病理類型，其中肝細胞癌占到85%～90%以上［2］。原代肝癌細胞培養可使肝癌細胞最大程度地保持其在體內的各種生物學特性，有利于對肝癌的發病機制及其防治進行深入的研究。目前國內外尚無相關的綜述，本文在此主要針對肝細胞癌，對其原代培養的過程、方法及相關培養條件進行簡要介紹，以期為后續的基礎及臨床研究做好鋪墊。

1 取材及預處理

腫瘤組織主要來源于肝癌患者手術切除的標本或細針穿刺活檢的標本，并且要求患者未接受過任何抗腫瘤治療。對于手術切除的肝癌標本，應從瘤體生長活躍、無壞死變性的邊緣部位多點取材。取下的標本須立即放入冰浴的培養基中，并盡快送至實驗室處理。文獻［3］建議熱缺血時間不應超過20 min，而冷缺血時間最好控制在1 h以內。另外，在進行分離之前應先將標本上的血塊、壞死組織以及結締組織剪掉，用培養基漂洗數次。細針穿刺活檢的標本則可以通過反復離心和重懸靜置的方法盡可能除去血細胞［4］。有一點需注意的是，不論是何種標本，取材均應在不影響病理診斷的前提下進行，且事先應征得患者及醫院倫理委員會同意。

2 分離方法

2.1 機械法 最常用的為剪碎法。此法直接將組織剪碎成約1 mm3的小塊，然后轉入T25培養瓶中，加入少量含10%～20%胎牛血清的RPMI?1640培養液或DMEM培養液，倒置貼附2～3 h后翻轉培養瓶，繼續培養至細胞爬出［4-9］。

日本岡山大學MATSUURA［7］通過腹腔鏡穿刺活檢及組織塊培養，從3例肝硬化患者身上成功構建出1株肝癌細胞系，細胞活率在90%以上，且24 h貼壁率為90%，該細胞系在起初的5個月內一直維持其細胞形態而無任何增殖表現。高雄醫學大學附設中和紀念醫院林子堯等［4］用超聲引導下細針穿刺獲得的肝癌標本進行組織塊培養，結果15例中共成功培養6例，腫瘤細胞培養3代后生長穩定并用于進一步的藥敏試驗。羅馬尼亞TOMULEASA等［6］對1例肝癌手術標本進行組織塊培養，2周后團塊周邊出現散在的單個細胞，到第3周細胞即呈單層貼壁生長，細胞活率＞80%，該細胞隨后被成功用于腫瘤干細胞的研究。復旦大學附屬中山醫院高強等［5］對55份來源于10例乙肝相關肝細胞癌的標本進行組織塊培養及多區域測序，發現了廣泛的瘤內異質性（intratumor heterogeneity），并由此建立了一套基于基因檢測的化療藥物敏感性預測模型，而其獲得低傳代細胞所需時間大致為1個月［5］。

廣東醫學院林滿洲等［10］采用組織薄片法進行原代肝癌細胞培養，不同之處在于其并非將組織剪碎，而是利用固定在一起的兩塊手術刀片的間距切取組織薄片。該法在培養成功率、細胞爬出時間及肝癌特異性標記物GPC3的表達上與傳統的組織塊培養法并無顯著差異，但薄片法培養的細胞在形態及潔凈程度上較組織塊法好。

2.2 酶消化法 包括膠原酶消化法和胰酶消化法。膠原酶又稱為膠原蛋白水解酶，能特異性地水解結締組織中膠原纖維天然存在的三維螺旋結構而對細胞無明顯損傷［11］。胰酶（指胰蛋白酶）主要用于分解組織間質蛋白，但對細胞膜也有較強的破壞作用。盡管膠原酶價格昂貴，但由于其作用溫和、消化后細胞活率高而被廣泛應用于動物及人肝細胞的分離，以下主要介紹膠原酶消化法。

膠原酶消化法首先也是將組織剪成1 mm3左右的小塊，然后加入適宜濃度（0.05%～0.10%）的膠原酶（Ⅱ型或Ⅳ型）37℃下消化一定時間（從20 min至1 h不等），再用篩網或紗布過濾，反復低速離心，最后重懸即可［12-15］。

DOUMBA等［12］采用0.1%的Ⅳ型膠原酶對11例早期肝癌合并肝硬化的手術標本進行原代培養，平均產量可達7×106，細胞活率與純度分別為90%與85%。國內昆山市第一人民醫院的陳敏斌等［13］用Ⅰ型膠原酶消化30 min，從8例原發性肝癌標本中成功培養2株細胞系，并對KU?0060648的抑瘤機制進行了深入研究。浙江省人民醫院王震等［14］將消化時間延長至1 h，結果2例標本均培養成功，第3代至第10代的細胞被用于后續mTOR激酶抑制劑CZ415的研究。第二軍醫大學的黎江［15］采用0.05%的Ⅰ型膠原酶及優化的新型無血清培養基，對腫瘤組織直接進行消化培養，獲得2株肝癌干細胞樣的球狀細胞系，在連續傳代7代后生長趨于穩定，約4 d傳一代。同時，他們通過異種移植成功構建了人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，反復傳代至第5代后取出進行培養，亦成功培養1株呈上皮狀生長的人肝癌細胞系和1株肝癌干細胞樣的球狀細胞系，后者連續傳代8代后生長趨于穩定，約4 d傳一代。

3 細胞的純化

3.1 低速離心法 由于肝細胞密度大于非實質細胞，可以通過反復低速離心（50～100g離心3～5 min，重復3～5次）收集到絕大多數肝細胞。此法常用于動物及人肝細胞的純化，有研究顯示其純化效果與Percoll密度梯度離心法接近，但耗時更短、成本更低、操作簡單。

3.2 密度梯度離心法 其原理主要是利用細胞之間的比重差異對不同細胞進行分層純化，目前應用較廣的分離液有 Percoll和 Ficoll?Hypaque。Percoll是一種表面包被聚乙酰吡咯烷酮的硅膠顆粒，由于其擴散常數低，所形成的梯度十分穩定。此外它不穿透生物膜，對細胞無毒害作用，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。因為富含活力的肝細胞密度范圍為1.08～1.09 g/mL，而受損的肝細胞、非實質細胞及細胞碎片的密度均在1.07 g/mL以下，故可以采用40%～50%的Percoll分離液進行純化。也有學者推薦采用25%的Percoll分離液［16-17］。Ficoll?Hypaque是蔗糖的多聚體，呈中性，也不穿透生物膜。北京大學臨床腫瘤學院的張志謙等采用Ficoll?Hypaque密度梯度離心法（75%/100%）對原代肝癌細胞與腫瘤浸潤淋巴細胞進行分離、培養，并首次證實免疫療法對復發性肝癌中的干細胞樣細胞具有靶向作用［18］。

3.3 胰蛋白酶消化法 適用于成纖維細胞多而旺盛、貼壁較好，而腫瘤細胞量少、貼壁能力較差時［11］。大致流程為向PBS沖洗后的培養瓶內加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，顯微鏡下觀察當大多數腫瘤細胞脫落而成纖維細胞尚未脫落時終止消化，收集上清離心即可得較純化的腫瘤細胞。事實上，實際操作中經常聯合使用幾種純化方法來達到最佳的純化效果，所以沒有必要拘泥于某一種具體的方法。

4 肝癌細胞的鑒定

目前病理診斷常用的肝細胞癌標志物有肝細胞石蠟抗原-1（hepatocyte paraffin antigen 1，Hep Par?1）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican?3，GPC?3）、CD34、多克隆性癌胚抗原（polyclonal carcinoembryonic antigen，pCEA）、CD10、精氨酸酶-1（arginase?1，Arg?1）、甲胎蛋白（α?fetoprotein，AFP）等［19］。

Hep Par?1是1993年WENNERBERG等［20］以石蠟包埋的肝組織內線粒體作為抗原克隆出的一種新的單克隆抗體，在肝細胞源性腫瘤中陽性率較高，但無法鑒別腫瘤的良惡性。GPC?3由PILIA等［21］于1996年首先描述，屬于硫酸類肝素糖蛋白聚糖家族中的一員，通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）結合于細胞表面。GPC?3在人體胚胎期的胎盤、胚肝、胚肺及胚腎等組織中呈高表達，而成人僅在肺和卵巢等少數組織有低表達，正常肝組織未見表達［22］。GPC?3對肝細胞癌的診斷具有很高的特異性，且不受腫瘤分化程度的影響，但其敏感性欠佳［23］。Arg?1是一種雙核含錳金屬酶，在肝臟中高表達，可將精氨酸代謝為鳥氨酸和尿素，進而參與尿素循環，對體內氨解毒起重要作用［24］。Arg?1是一種非常敏感的肝細胞癌標志物，但它同樣不能區別肝細胞源性腫瘤的性質。AFP為肝癌細胞返祖性合成的一種高分子質量胚胎蛋白，目前仍是臨床上最常用的診斷原發性肝癌的血清標志物［2］，其特異性很強但敏感性較低。

以上幾種肝細胞癌標志物的比較如下：敏感性：Arg?1＞GPC?3＞Hep Par?1＞AFP；特異性：AFP＞GPC?3＞Hep Par?1＞Arg?1；陽性預測值：AFP＞GPC?3＞Arg?1＞Hep Par?1；陰性預測值：GPC?3＞Arg?1＞AFP＞Hep Par?1［24］。可見，聯合檢測Arg?1和GPC?3對肝癌細胞的鑒定具有極高的敏感性和特異性，有助于提高結果的準確性。

5 培養基的選擇

現有的報道基本上都采用DMEM、RPMI?1640和Williams′E 3種培養基。DMEM和RPMI?1640廣泛用于各種原代細胞的培養，而Williams′E是肝細胞專用培養基。其他如無血清培養基HepatoZYME?SFM也常用于原代肝細胞的培養，但鮮有用于原代肝癌細胞的培養。有研究顯示Williams′E相較于其他幾種培養基更適合于原代肝細胞的短期培養［25-26］。實際上，人們往往會根據研究的需要在這些培養基中添加不同的組分，例如胎牛血清（fetal bovine serum）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、胰島素（insu?lin）、地塞米松（dexamethasone）、胰高血糖素（glucagon）、谷氨酰胺（l?glutamine）等。

血清的主要作用在于提供細胞生長增殖所需的激素、生長因子、轉移蛋白和其他營養物質，維持細胞較好的生長狀態，促進細胞的生長與分裂增殖［27］。然而，也有研究［26］表明在血清的長期作用下肝細胞會逐漸失去其原有的表型，有趣的是，恰恰也是利用這一點，無血清培養基被廣泛用于肝臟干細胞的研究［28］。HGF被認為在肝再生過程中起到最重要的作用，其他細胞因子起到不同程度的輔助作用［29］。當細胞進入G1期后，HGF和EGF等細胞因子通過促進細胞有絲分裂，使細胞進入S期，促進增殖［30］。胰島素可通過作用于肝細胞表面的胰島素受體，增強肝細胞對葡萄糖的攝入和利用，同時促進RNA、蛋白質和脂肪酸的合成，抑制細胞凋亡，從而增強肝細胞的活力與功能［31］。地塞米松、胰高血糖素為體內重要的激素，參與細胞的糖代謝、脂類代謝等，調節細胞的增殖與功能表達［32］。谷氨酰胺是人體內含量最豐富的游離氨基酸，也是一種條件必需氨基酸［33］。作為DNA合成的前體，保持充足的谷氨酰胺有利于DNA合成，促進細胞分裂再生。其次谷氨酰胺通過生成谷胱甘肽這一機體保護酶和其他蛋白質巰基對抗自由基損害的抗氧化劑，減輕氧自由基造成的肝細胞損傷，促進肝組織再生［34］。

6 培養模型

迄今原代肝癌細胞的培養仍主要采用傳統的二維貼壁培養模型，這一點和三維培養模型在正常原代肝細胞的研究中正如火如荼形成鮮明的對比［17，35-38］。相比于二維培養模型，三維培養模型現已成為公認的能較好模擬體內腫瘤細胞微環境及細胞間相互作用的體外模型。目前三維培養模型主要包括三明治培養模型、聚球培養模型、去細胞支架培養模型、生物反應器培養模型、微流控培養模型等。其中，動態培養模型因具有類似體內的流體梯度及較好的可控性，是未來的研究熱點。本課題組在前期的研究中采用三維培養模型培養原代肝癌細胞，細胞在形態及功能上均優于二維培養模型（相關結果尚未發表），這也驗證了上述觀點。

7 總結

目前肝癌細胞的原代培養主要用于細胞建系/株和體外藥敏試驗，但受限于種種客觀因素仍無法做到大范圍的推廣。主要存在的問題有：（1）人肝癌細胞的原代培養難度遠大于動物及人正常的肝細胞，標本來源受限，培養成功率低；（2）由于標本的臨床及病理特征參差不齊，加上廣泛存在的瘤內異質性，實驗數據的可比性及可信度均大打折扣；（3）如何保持原代肝癌細胞生物學特性的穩定，這也是原代培養技術共同面臨的一大難題；（4）如何避免成纖維細胞等雜細胞的污染，使研究結果能更真實地反映肝癌細胞的特性。

總之，原代肝癌細胞的培養方法盡管存在諸多不足，但其在肝癌細胞的體外研究中仍舊具有不可替代的重要作用。未來除了進一步改善其分離、純化方法以及對培養基進行優化，還可以嘗試使用三維動態培養模型以達到更接近體內環境的目的。我們相信，肝癌細胞原代培養技術的不斷完善必將推動肝癌的基礎及臨床研究，進而為更多的肝癌患者帶來新的福音。

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