經典Wnt信號通路與結腸腫瘤干細胞關系的研究進展

朱生琳，朱蓉，趙逵

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563000)

結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其病死率位居癌癥的第3位[1,2]。隨著我們國家日新月異的經濟發展和生活習慣的改變，結腸癌的發病率呈現逐年遞增的趨勢，因此對結腸癌的防治研究迫在眉睫。腫瘤干細胞(CSC)是腫瘤少量具有自我更新、多向分化潛能及無限增殖和異質性的細胞亞群[3]，可為腫瘤的發生、發展、轉移以及為最新的靶向治療提供理論基礎。Wnt信號通路對細胞發育分化、修復起著關鍵的調控作用，是細胞生長、分化的起始信號。Wnt信號通路主要有Wnt/β-catenin、Wnt/PCP、Wnt/calcium 3種傳導方式[4]，其中Wnt/β-catenin是經典Wnt信號傳導通路，主要調控細胞的增殖能力。大量研究表明，經典Wnt信號通路參與CSC的分子調控，破譯其關系也許可以從根源上遏制腫瘤的發生、發展及轉移，對腫瘤防治有重要意義。本文就經典Wnt信號通路與結腸CSC存在的信號級聯關系綜述如下。

1 經典Wnt信號通路對結腸CSC生成的調控

研究認為，CSC可能來源于干細胞發生特定的基因突變，成為具有無限增殖能力的異質性細胞。大量實驗顯示，在自我更新和多向分化潛能方面，腸道干細胞(ISC)與結腸CSC具有類似的生物學特性。例如，二者有相同的標記物Lgr5、CD133、CD44。結腸干細胞在腸道隱窩基底部沿著“隱窩”-“絨毛”軸不斷的分化向上遷移，從而維持了腸道組織的穩態平衡和自我更新；并且，研究發現β-catenin在結腸隱窩基底部的表達最強，并沿著“隱窩”-“絨毛”軸由強漸弱[5]。因此，經典Wnt信號通路對于ISC調控細胞的起始增殖分化有著重要的作用。研究顯示，敲除轉基因新生小鼠的T細胞轉錄因子4(TCF4)、選擇性抑制轉基因小鼠中經典Wnt通路的激活，或者選擇性切除β-catenin或TCF4片段，都可使腸道隱窩內ISC銳減。因此，隱窩內環境的穩態和ISC自我更新都離不開經典Wnt通路的激活傳導[6～8]。

CSC是構成腸道腫瘤組織的一小部分，其角色相當于正常組織里面的ISC，而CSC就相當于腫瘤細胞起始的“種子”。根據其相似的生理功能，在腸道中提出了“自上而下”和“自下而上”兩種假設模型。“自上而下”模型認為，結腸CSC是由部分已分化的細胞重新獲得類干細胞樣的特性，發展為腫瘤并在隱窩部產生異常病灶；“自下而上”模型認為，結腸CSC是隱窩基底部的干細胞發生基因突變，向外擴、張向上遷徙成為腫瘤的起始“種子”。這兩種模型都受經典Wnt信號通路的調控：①在“自上而下”模型中，超活化的β-catenin-TCF信號可使分化的腸道上皮重新獲得多能性，從而形成新的不受調控的類隱窩結構，隨后發生腺瘤[9]。在結腸頂端早期腺瘤的觀察中發現，已分化細胞是結腸CSC致瘤性轉化的“種子”起源細胞；在腸道腫瘤的轉基因小鼠模型中顯示，已分化的上皮細胞具有能重新獲得類干細胞樣的功能[10]，通過聯合激活經典Wnt通路和核因子κB(NF-κB)信號可獲得腫瘤細胞特性[11]。②在“自下而上”模型中，對早期散發的結腸腺瘤免疫組化研究顯示，腺瘤病變部位靠近隱窩基底部，病變部位β-catenin在核內的積聚，維持了其對應的表皮細胞β-catenin在亞膜間隙的連接[12]。在結腸腺瘤性息肉病基因(APC)缺失的結腸隱窩基底部干細胞，可被迅速誘導轉化為結腸微腺瘤。這表明增加Lgr5+干細胞艙中經典Wnt的活性，可誘發產生結腸CSC[13]。以上研究都表明，經典Wnt信號過度活化是干細胞艙中致瘤性轉化至關重要的因素，而腸道上皮在慢性炎癥等條件下增加NF-κB信號也同樣可使細胞去分化。另外，由于經典Wnt信號通路的過度活化，也可導致隱窩基底部的ISC產生基因突變轉化為腸道CSC。

2 Lgr5是經典Wnt信號通路誘導結腸CSC產生的標志

Lgr5是經典Wnt信號通路的靶基因，同時也是ISC和CSC常見的表面標記[14]。在小鼠結腸癌模型的研究中顯示，在經典Wnt信號通路過度活化(敲除APC基因)模型中，腸道中的Lgr5+亞群導致了結腸腺瘤的形成[15,16]。因此，Lgr5+細胞被認為是腫瘤的初始細胞。在實驗中結合ISC所具有的生物特性，可通過Lgr5細胞表面標記物，將結腸CSC從結直腸癌(CRC)組織中分離出來。高表達Lgr5的CRC細胞在試管中的增殖具有更強的克隆能力，而抑制Lgr5的表達會導致其喪失形成集落的能力[17]。高水平的Lgr5-ISC腫瘤基因特性是更具侵襲和轉移能力，也揭示了CRC患者的高復發趨勢[18]。在19種公認的干細胞標記中，Lgr5在人體CRC樣本中有74%普遍表達率，Lgr5和Ascl2以及其他基因一起共表達，印證了腺瘤來源于Lgr5+/Ascl2+隱窩干細胞這一假設。對CRC經手術治療復發患者的研究顯示，Wnt信號通路靶基因(Lgr5、Ascl2、Axin2、Dkkl和Apcdd1)的表達與疾病復發呈負相關，經典Wnt信號通路靶基因高表達與良好的預后密切相關[17]。基于對CRC細胞系的研究發現，這些經典Wnt靶基因可被CpG甲基化選擇性沉默。因此，在結腸CSC中經典Wnt靶基因甲基化，可導致CRC復發概率增高。

3 由經典Wnt信號通路誘發的結腸CSC參與CRC的轉移

研究發現，在腫瘤組織侵襲前細胞核中表達出高水平β-catenin。這些細胞是通過上皮間質轉化(EMT)而來的，具有更強的增殖能力和侵襲力，意味著經典Wnt信號通路誘導CSC在轉移中扮演著重要角色。大量研究表明，EMT在CSC增殖中起著關鍵的管理調控機制，尤其表現在乳腺癌細胞系中。同樣的在CRC中，EMT影響著其惡性程度與遠端轉移，包括結腸CSC的增殖、腫瘤的發育、循環腫瘤細胞以及耐藥性[19]。結腸CSC具有的自我更新和分化能力，使其可以更好地去調節適應腫瘤轉移的各種不同階段。在具有過度活化的經典Wnt信號通路的晚期結腸腫瘤CSC細胞中發現，Lgr5的表達與CRC腫瘤細胞株的惡性潛能聯系密切。在高表達的Lgr5結腸腫瘤中，其腫瘤分期越高、侵襲性更強、淋巴結轉移概率更大[20]。隨著研究的深入，“遷徙腫瘤干細胞(MCSCs)”假設被提出，由結腸CSC參與的結腸腫瘤轉移是轉移的主要驅動力[21,22]。根據該實驗模型，結腸CSC內在的適應性導致了結腸癌獲得更強的侵襲性，可通過血液以及淋巴管遷徙至遠端的器官，從而發展至腫瘤晚期階段。新形成的轉移瘤和同源的原位癌有著高度相似基因和蛋白，這表明定植后的MCSCs可重新轉化為它們最初的表型[23]。在與具有原位CRC細胞組織和肝轉移患者的基因表達中發現，Ascl2在轉移瘤以及一些經典Wnt信號通路誘導的ISC中表達上調，其他還包括Lgr5、EphB3、Ets2、Smoc2[24]和Sox9[23]。

4 以經典Wnt信號通路為靶點抑制結腸CSC

在靶向藥物的研究中，我們可從4個方面來調控經典Wnt信號通路繼而影響結腸CSC的增殖、分化與轉移。①在細胞外及細胞膜方面，激活經典Wnt信號通路可以影響Wnt配體、Fzd、LRP5/6、Wnt抑制因子、dikkopf以及Frizzled家族分泌蛋白的表達水平。②在細胞質方面，通過干預APC、Axin、β-catenin以及激活狀態的環氧化酶(COX)-2的表達水平，可以影響β-catenin在細胞內的累積量和穩定性。③在細胞核方面，LEF/TCF的轉錄、AMP應答因子結合蛋白CBP、c-myc以及D1同樣調控結腸CSC的增殖和分化。④其他信號通路同樣也能作用于經典Wnt信號通路，對結腸CSC產生不同程度的影響。

非甾體抗炎藥(NSAIDs)已經證實對于腫瘤具有抑制作用，并且已成為重要的結腸癌化療藥物。其作用機制主要是通過抑制COX中的關鍵信號花生四烯酸，但不同的NSAIDs抑癌機制不同。例如，阿司匹林、塞來昔布通過抑制經典的Wnt信號通路發揮抑癌作用。塞來昔布選擇性抑制COX-2，并且在經典Wnt信號通路中降低TCF，這一機制被用于治療家族性腺瘤息肉病。近年來，研究發現使用塞來昔布的APC患者中70%可降低腸息肉的形成[25]，這給結腸癌的治療指出新方向。實驗中NSAIDs能夠誘導人結腸息肉細胞凋亡，并在APCMin/+小鼠[26]中能夠有效清除ISC的異常Wnt信號。其機制是激活APC缺失細胞中的Bcl-2同源結構3域，相繼導致c-myc的激活[27]，進一步揭示了NSAIDs在腫瘤中可誘發凋亡信號。

綜上所述，經典Wnt信號通路對體內動態平衡和發展起著重要的作用，參與生長發育、分化等多種復雜的生理過程；該通路同樣也是ISC的主要調控器，對腸道腫瘤的發生發展起著至關重要的作用。現階段在結腸干細胞基礎上提出了CSC理論，并發現經典Wnt信號通路和CSC及Lgr5、Ascl2、Axin2、Dkkl和Apcdd1等多種經典Wnt信號通路靶基因及CSC標記的表達與腫瘤的轉移和復發存在關聯。但是，腸道腫瘤的發生、發展、轉移是連續性、多環節、多過程的生化過程，其作用機制至今尚未明確，有待進一步的研究和探索。

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