肝癌組織中kinectin基因V4L異構體表達及其與血清kinectin抗體的關系

閆磊，黃天明，羅國容

(1牡丹江醫學院，黑龍江牡丹江157011；2廣西醫科大學)

研究發現，人類動力素蛋白(kinectin)可能存在8個選擇拼接區(V1～V8)，其中V4選擇拼接區所對應的氨基酸序列為3 278～3 364 bp，其拼接方式的不同可產生多種功能不同的kinectin異構體。2015年1月～2016年12月，我們采用RT-PCR法檢測kinectin基因V4L異構體在人肝癌組織與癌旁組織、正常肝組織中表達的差異性，為探索V4L異構體與肝癌發生、kinectin抗體的產生是否存在關聯提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 經廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會許可，于醫院肝膽外科收集45例肝癌患者的癌組織標本、配對癌旁組織及血清標本，10例正常肝組織標本取自肝囊腫、肝外傷患者。肝癌患者中男39例、女6例，年齡32～75歲，術前均未行任何抗腫瘤治療。胎牛血清、胰蛋白酶、TRIzol Reagent(美國Gibco公司)；DMEM/F12培養基、D-Hank′s液(美國Hyclone公司)；系統多通道PCR儀(MJPT-220)、Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 kinectin基因V4L異構體檢測方法 采用RT-PCR法。根據GenBank人類kinectin全長序列中V4選擇拼接區的序列，應用Primer5設計引物，設計的引物跨越V4區，可得到2個目的片段：V4L(包含V4選擇拼接區的長kinectin 異構體)、V4S(不包含V4選擇拼接區的短kinectin 異構體)。引物由上海捷瑞基康生物技術有限公司合成，V4上游引物5′-TTAGATTCTTTGAAGGATGCAGTTGA-3′、下游引物5′-AGATCGTTCCATCTCTGCCTTTTC-3′，擴增片段長度621 bp(V4L)、534 bp(V4S)；內參照β-actin上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′、下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，擴增片段長度225 bp。采用TRIzol試劑一步法提取組織RNA，逆轉錄合成cDNA，進行PCR 擴增。PCR反應體系(25 μL): 去離子水9.5 μL，10×Master Mix 12.5 μL，上下游引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，模板cDNA 2.0 μL。PCR反應參數：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后用Bio-Rad 凝膠成像儀成像，用凝膠成像分析系統觀察并分析結果。用美國Bio-Rad凝膠成像分析系統對電泳條帶進行灰度掃描，以Quantity One軟件計算V4L/β-actin、V4S/β-actin，從而得出2種目的基因的相對含量，以V4L/V4S表示kinectin基因V4L異構體的相對表達量。

1.3 肝癌患者血清kinectin抗體檢測方法 采用ELSIA法。用包被緩沖液將MBP-kinectin稀釋至5.0 μg/mL，取100 μL/孔包被酶標板，4 ℃濕盒過夜。5%脫脂奶(300 μL/孔)37 ℃封閉1 h后，陽性對照和空白對照加入待檢稀釋血清(1∶16)各100 μL/孔，37 ℃濕盒孵育2 h。加入Biotin-綿羊抗人IgG單克隆抗體(1∶5 000)，37 ℃濕盒溫育2 h，1×PBS-T洗板5次。加入streptavidin-HRP(1∶4 000)，37 ℃濕盒溫育1 h，1×PBS-T洗板4次。TMB避光顯色20 min，加1 mol/L的H2SO4終止反應，酶標儀波長450 nm處讀取OD值。空白對照用PBS代替血清，其余步驟同上。血清kinectin抗體水平以滴度表示。

2 結果

2.1 不同肝組織中kinectin基因V4L異構體表達情況比較 肝癌組織中kinectin基因V4L/V4S為2.709±1.025，癌旁組織中為1.564±0.357，正常肝組織為1.507±0.499；經兩兩比較，肝癌組織中V4L/V4S高于癌旁組織和正常肝組織，差異有統計學意義(F=29.698，P=0.000)。

2.2 肝癌患者血清kinectin抗體與肝癌組織中kinectin基因V4L異構體表達的關系 肝癌患者血清kinectin抗體滴度值為0.170 7±0.023 1，與肝癌組織中kinectin基因V4L/V4S不相關(r=-0.410，P>0.05)。

3 討論

kinectin是一種與囊泡轉運相關的膜受體蛋白，主要定位于內質網膜上。人的kinectin基因由46個外顯子共4 816個核苷酸組成，開放閱讀框位于188～4 258核苷酸處[1]。kinectin基因上可能存在多個選擇拼接區，可通過構成多種不同的選擇拼接異構體蛋白而行使不同的功能[2]。選擇性拼接是一種常見的真核生物hnRNA轉錄后加工的方法[3,4]。很多研究發現，腫瘤組織中某些基因選擇性拼接發生異常改變，導致該基因選擇性拼接異構體出現過度表達或表達降低促使腫瘤發生[5,6]。V4選擇拼接區包含87個堿基對，其缺失將導致29個氨基酸的缺失，V4選擇拼接區拼接方式的不同可能產生不同的kinectin異構體。不同的kinectin異構體有不同的功能，其比例平衡維持著kinectin的正常生理功能；而異構體之間的比例失調，將可能導致kinectin的正常生理功能發生紊亂，從而導致細胞病變[7～12]。

本研究發現，在肝癌組織中kinectin基因V4L異構體表達高于癌旁組織和正常肝組織，這表明V4L異構體在肝癌組織中過度表達，可能與肝癌發生存在關聯。在正常肝組織中kinectin占優勢地位的異型體為V4S，即V4選擇拼接區被剪接掉的kinectin異構體；而當kinectin基因選擇性拼接的調控機制發生異常時，可能使V4選擇拼接區的選擇性拼接發生相應的改變，導致V4L異構體過量表達，使kinectin異構體之間的比例發生改變，進而影響了kinectin的正常生理功能從而導致細胞病變。有學者[5]推斷，肝癌患者血清中kinectin抗體產生的機制，可能與V4L異構體過度增殖并且發生抗原性改變而被免疫系統識別有關。本研究對肝癌組織kinectin基因V4L/V4S與血清中kinectin抗體滴度值進行比較，尚未發現兩者之間具有相關性，未證實該學者的觀點。可能原因如下：①個別肝癌患者可能會出現免疫耐受[13～15]，免疫活性細胞接觸V4L異構體后表現出特異性的無應答狀態，不產生抗體；②抗體產生的階段性；③本實驗樣本數量只有45例，在相關分析時，樣本量過少。kinectin抗體的產生機制還比較復雜，有待進一步研究，今后將增大樣本量繼續進行探索。

目前，關于kinectin選擇拼接區的研究在國內外還很少，處于剛剛起步階段。隨著研究的不斷深入，將可能闡明kinectin作為肝癌相關抗原的機制，為其進一步開發與應用奠定基礎。

：

[1] Fütterer A, Kruppa G, Krmer B, et al. Molecular cloning and characterization of human kinectin[J]. Mol Bio Cell,1995,6(2):161-170.

[2] Santama N, Er CP, Ong LL, et al. Distribution and functions of kinectin isoforms[J]. J Cell Sci, 2004,117(Pt 19):4537-4549.

[3] 徐谷峰,周承亮,黃荷鳳,等.選擇性剪接調控的研究進展[J].上海交通大學學報(醫學版),2015,35(5):769-771.

[4] 徐敏杰,竇同海,徐佳熹,等.癌癥相關基因選擇性剪接進化數據庫的構建[J].復旦學報(自然科學版),2016,55(5):649-659.

[5] Xin Y, Grace A, Gallagher MM, et al. CD44V6 in gastric carcinoma: a marker of tumor progression [J]. App Immunohistochem Mol Morphol Aimm, 2001,9(2):138-142.

[6] Wang L, Duke L, Zhang PS, et al. Alternative splicing disrupts a nuclear localization signal in spleen tyrosine kinase that is required for invasion suppression in breast cancer [J]. Cancer Res, 2003,63(15):4724-4730.

[7] 侯朋飛,金宏麗,李嶺,等.鼠源Bif-1蛋白7種選擇性剪接異構體真核表達質粒的構建及鑒定[J].中國生物制品學雜志,2016,32(1):906-911.

[8] 邢永強,劉國慶,蔡祿,等.Pre-mRNA選擇性剪接的調控及選擇性剪接數據庫[J].中國生物化學與分子生物學報,2017,30(9):906-911.

[9] 王文君,史志周.環狀RNA在腫瘤癌變中的作用機制和臨床意義[J].中國老年學雜志,2017,37(1):229-230.

[10] 陳力,李金平,晁耐霞,等.GCF2選擇性剪接區在肝癌組織及細胞株中的表達及意義[J].廣西醫科大學學報,2014,31(3):355-357.

[11] 陳偉霞,陳彬,徐燕,等.選擇性剪接調控蛋白PTB及同源蛋白的研究進展[J].現代生物醫學進展,2017,17(33):6561-6535.

[12] 楊志崗,馬世澤,傅歆,等.CD49f剪接異構體在不同細胞系中的表達[J].基礎醫學與臨床,2017,37(11):1562-1567.

[13] 林川川,宋志強,羅娜.新式免疫佐劑在過敏原特異性免疫耐受治療中的研究進展[J]. 免疫學雜志,2017,33(11):1003-1008.

[14] 辛勝,楊麗莎,譚占超,等.HBV感染不同免疫狀態與PCⅢ、C-Ⅳ表達水平的關系[J].山東醫藥,2012,52(13):10-12.

[15] 高紅艷,劉娜,李春霞,等.慢性HBV感染者免疫耐受期自然轉歸相關影響因素的研究進展[J].臨床肝膽病雜志,2017,33(8):1572-1575.