胃上皮細胞經亞硝基化合物MNNG短時刺激后細胞形態、功能特性的變化

蔡潔，王梅

(1江陰市人民醫院，江蘇江陰214400；2江蘇大學醫學院)

腫瘤是一個全球性的重大公共衛生問題，目前在中國乃至世界，惡性腫瘤仍舊是第二大死亡原因，且發病率還在不斷上升[1]。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，尤其在我國其新發病率已升至第2位，僅次于肺癌[2]。許多因素導致了胃癌的發生與發展，如飲食、吸煙、肥胖、環境、家族遺傳以及慢性感染等都是主要的影響因素[3,4]。在中國，胃癌的發病率和病死率居高不下與中國人的飲食習慣息息相關，中國人偏愛腌制食品，而腌制品中含有大量致癌物質(如亞硝酰胺類化合物)，這是胃癌發生的關鍵因素[5]。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是一種人工合成的亞硝基化合物(NOCs)，科研中經常用MNNG代替自然界中的亞硝酰胺類化合物來探究其在胃癌形成中的作用[6]。GES-1細胞系是永生化的胃上皮細胞系，是經SV40病毒轉化人胃上皮細胞得到的，能在體外長期傳代，因此被廣泛用于胃上皮細胞惡性轉化以及胃癌發生的相關研究中[7]。2014年3～ 8月，我們用MNNG短時刺激GES-1細胞，觀察GES-1細胞形態和特性的變化，探討其可能的原因，進一步了解MNNG在胃癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 GES-1細胞購自北京腫瘤防治研究所，化學致癌物MNNG(美國Sigma公司)；GAPDH抗體(中國康為公司)，E-cadherin抗體(美國Santa Cruz公司)，N-cadherin抗體(美國Abcam公司)，抗鼠Goat anti-mouse IgG (HRP，美國Santa Cruz公司)，抗兔Goat anti-rabbit IgG (HRP，美國Santa Cruz公司)，曝光液(美國Millipore公司)；RPMI1640培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶T+E(美國Sigma公司)，RIPA+PMSF(美國Vazyme公司)，二甲基亞砜(DMSO,美國Sigma公司)，蛋白預染Marker(美國MBI公司)，結晶紫染料(中國艾然公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將GES-1細胞接種于含10% FBS的RPMI1640培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，根據生長情況每隔2～3 d換培養液1次；當細胞融合度達到近80%時，按1∶3比例傳代，然后繼續培養。

1.2.2 MNNG短時刺激GES-1細胞 用適量DMSO溶解MNNG粉末，配成0.2 mol/L的MNNG溶液；用含10% FBS的RPMI1640培養液稀釋MNNG溶液至1×10-5mol/L，濾器過濾。預先將適量的GES-1細胞種于6孔板中，培養24 h；加入1×10-5mol/L的MNNG溶液避光刺激0、4、8、12 h，接著撤去MNNG；用PBS緩沖液洗滌至少3次，用于后續實驗。

1.2.3 細胞形態學觀察 分別取GES-1細胞和經MNNG作用不同時間點的GES-1細胞，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態，并拍照保存。

1.2.4 細胞增殖活性觀察 采用平板克隆形成實驗。將GES-1細胞和MNNG短時刺激的GES-1細胞消化計數，按1 000個細胞盡量均勻地種于直徑3.5 cm細胞培養皿中；培養12 d后，PBS緩沖液洗滌至少3次；加4%多聚甲醛固定30 min，PBS緩沖液再洗滌3次；加結晶紫染色15 min，繼續用PBS緩沖液洗滌干凈；最后用照相機拍照，數出每個細胞培養皿中的細胞克隆數。實驗至少重復3次。

1.2.5 細胞遷移能力觀察 采用Transwell遷移實驗。將GES-1細胞和MNNG短時刺激的GES-1細胞同時用胰酶消化，離心后用無血清RPMI1640培養液懸浮，計數后配成5×105/mL的細胞懸液。在24孔Transwell板下室加600 μL含10% FBS的RPMI1640營養液，上室內加入200 μL已配好的均勻細胞懸液，放入培養箱中培養12 h；取出上室，用4%多聚甲醛固定，棉簽擦拭小室內未遷出的細胞；結晶紫染色15 min，PBS緩沖液洗凈染液；在倒置顯微鏡的低倍鏡下拍照，每孔隨機拍攝6個視野，計數每個視野的細胞。實驗至少重復3次。以穿膜細胞數表示細胞遷移能力，數量越多遷移能力越強。

1.2.6 細胞中上皮-間質轉化(EMT)相關蛋白E-cadherin和N-cadherin檢測 采用Western blotting法。收集GES-1細胞和經MNNG作用不同時間點的GES-1細胞，離心后棄去上清；在細胞沉淀中加入適量蛋白裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF(250∶1)，每5 min在振蕩器上劇烈震蕩1 min，共5次；置于預先預冷至4 ℃的高速離心機中，以12 000 r/min離心15 min；吸取上清液并記錄其具體體積，用核酸蛋白測定儀檢測每組上清的總蛋白濃度。再向上清中加入是其總體積1/4的Loading Buffer，混勻，沸水煮5 min，使蛋白變性。配置8%的聚丙烯酰胺凝膠，根據所測各組蛋白的濃度，計算出上樣體積；按順序加樣后，恒壓電泳，恒流轉膜2 h，封閉1 h；用特異性單克隆抗體(E-cadherin、N-cadherin和GAPDH)孵育，4 ℃過夜。次日，用TBST洗膜液洗膜，孵育二抗；GAPDH用HRP標記抗鼠二抗孵育，E-cadherin和N-cadherin用HRP標記的抗兔二抗；37 ℃孵育1 h，再洗膜。最后，以曝光液為介質，用化學發光成像系統成像，保存圖片；用Photoshop分析條帶的灰度值，以灰度值大小來表示蛋白的相對表達量。實驗至少重復3次。

2 結果

2.1 MNNG短時刺激對GES-1細胞形態的影響 與正常GES-1細胞相比，MNNG刺激后的細胞更大，更扁平，邊緣不清晰，形狀不一，有些細胞成團塊狀生長；并且隨著刺激時間的延長，部分細胞呈紡錘形或不規則形，比未刺激細胞更加細長。

2.2 MNNG短時刺激對GES-1細胞增殖能力的影響 GES-1細胞經MNNG刺激0、4、8、12 h時，其克隆數分別為(82.00±1.16)、(89.67±3.28)、(81.33±1.76)、(85.67±1.45)個，各時點GES-1細胞克隆數比較差異無統計學意義。

2.3 MNNG短時刺激對GES-1細胞遷移能力的影響 GES-1細胞經MNNG刺激0、4、8、12 h時，其穿膜細胞數分別為(83.00±2.89)、(149.00±5.20)、(265.70±6.06)、(491.00±8.74)個，刺激時間越長穿膜細胞數越多(P均<0.05)。

2.4 MNNG短時刺激對GES-1細胞E-cadherin、N-cadherin表達的影響 隨著MNNG刺激時間延長，GES-1細胞E-cadherin表達逐漸降低而N-cadherin表達逐漸升高(P均<0.05)。見表1。

表1 MNNG短時刺激對GES-1細胞E-cadherin、N-cadherin表達的影響

注：與刺激0 h時相比,*P<0.05。

3 討論

研究認為，胃癌的病因非常復雜，至今其發生的具體病因和相關機制仍不清楚，但飲食習慣一定是一個相當重要的影響因素。NOCs被認為是強有力的致癌物質，也是胃癌發生的重要危險因素之一，人工合成的MNNG是NOCs中典型的代表。在國內外的實驗研究中，該化合物是常用于動物模型的誘導劑和致癌物，并已成功用MNNG在動物體內建立胃癌模型[6]。研究[8]發現，將一定濃度的MNNG避光作用于GES-1細胞，24 h后撤去MNNG溶液，這樣高濃度長時間受刺激的GES-1細胞發生大量死亡，少量殘存的細胞繼續培養增殖，成為經MNNG誘導惡性轉化后GES-1細胞株，即MC細胞株。MC細胞常被作為胃癌癌前病變細胞的體外模型，被廣泛用于胃癌發生機制的研究[9]。但是，在實際生活或模擬實驗中，一次性接受高濃度、長時間NOCs刺激的可能性比較小，通常都是低濃度短時間的刺激，而這類研究并不多。所以，本研究降低了MNNG濃度和刺激時間，側重于低濃度短時處理GES-1細胞。在該濃度和時間作用下，GES-1細胞的活性基本不受影響，胞體變大扁平，輪廓不清，周邊多呈毛刺狀；有些細胞兩端變細長，甚至呈紡錘形；大部分細胞生長無序，排列紊亂，成團塊狀生長，有類似腫瘤細胞的生長和形態學特點。但是，通過平板克隆實驗，比較刺激后的GES-1細胞與正常GES-1細胞的增殖能力，發現并無明顯差別。這可能是因為刺激力度有限，還未達到影響細胞增殖能力的程度。以上結果表明，低濃度短時MNNG刺激的GES-1細胞形態發生了一定變化，有惡性轉化的趨勢，但是其增殖能力還未有顯著變化。

EMT是指在特定的生理或病理條件下，上皮細胞向間質細胞轉化的現象[10]。在此過程中，上皮細胞發生質變，細胞失去極性，細胞間黏附性減弱，但獲得能動性和侵襲性[11]。EMT表型的獲得可促進細胞的遷移，破壞上皮樣結構體系，是腫瘤發生發展乃至腫瘤干性獲取的重要特征[12]。因此，EMT的異?；罨谠S多腫瘤的發生、侵襲和轉移中起關鍵作用，如胃癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌等。有報道[13]稱，MNNG預處理的GES-1細胞和MC細胞形態向間質樣變化，且遷移能力增強；經CCl2刺激后變化加劇，且獲得了EMT表型。本研究結果顯示，經MNNG低濃度短時刺激的GES-1細胞遷移能力增強，再結合考慮細胞形態學的變化，大膽提出MNNG使GES-1細胞發生了EMT轉化的假設。

在EMT轉化過程中,E-cadherin是關鍵的傳遞者，能通過加強細胞間黏附性來維持細胞極性并且組織上皮細胞排列[14]，還參與細胞內信號傳遞，從而控制細胞成熟、分化、生長和能動性，故而可作為侵襲抑制基因。EMT異?；罨瘯笶-cadherin表達下調，而向間質樣蛋白N-cadherin轉化;N-cadherin在EMT過程中表達上調[14]，其依賴于細胞環境，促進黏附和遷移；但這兩種特性受N-cadherin基因的不同部位調控，故而是相互獨立的。本研究結果顯示，MNNG短時刺激GES-1細胞后，細胞E-cadherin表達驟減，而N-cadherin表達急劇升高。這與假設相符，本研究所結果表明MNNG的確使GES-1細胞發生了EMT。

越來越多的證據顯示，腫瘤的各級進程都可能觸發EMT表型；胃癌的發生及其惡性特征就與E-cadherin突變相關，而N-cadherin表達與侵襲性胃癌相關[15]，通過抑制EMT轉化能增強化療藥物的療效[16]。因此，EMT在腫瘤發生、轉移、耐藥、預后以及復發等階段都起到關鍵作用。目前，引起腫瘤進程中EMT發生的機制有很多，比較被認可的是細胞因子發揮關鍵性作用，細胞因子通過調節轉錄因子的表達或者激活各種信號通路來誘導EMT發生。前列腺癌細胞受可溶性因子人胰島素樣生長因子(IGF1)刺激后，細胞中轉錄因子E盒結合鋅指蛋白(ZEB1)表達上調，從而引起EMT轉化[17]。白細胞介素6和轉化生長因子β通過上調轉錄因子Snail和p-Smad3，同時活化JAK/STAT3通路來增強肺癌中EMT轉化[18]。另外，Wnt/β-catenin信號通路和PI3K/AKT信號通路在胃癌的EMT發生中也扮演重要角色[15]。本研究中MNNG促使胃上皮細胞發生EMT轉化的機制還不清楚，今后也可以從細胞因子或轉錄因子著手進行下一步研究。

綜上所述，本研究發現化學致癌物MNNG短時刺激胃上皮細胞后，胃上皮細胞形態發生明顯變化，細胞遷移能力增強，并且發生EMT轉化，但誘導EMT發生的具體原因和機制還不清楚，這是今后需繼續探索和研究的方向。

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