獼猴腸道菌群基因組DNA提取及其ERIC-PCR分析

張蒙

（涼山州農業學校，四川 西昌 615000）

由于獼猴在形態學、生殖生理特性和生化代謝方面與人類非常相似，在醫學和生物學領域早已被作為理想的實驗動物。本試驗通過采集3個不同年齡段（幼年、青年、老年）獼猴的糞便樣本，提取其中的微生物總DNA，并應用ERIC-PCR技術對3種糞便中的菌群結構差異及相關性進行分析，為進一步研究腸道菌群與獼猴營養、消化和吸收的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1 材料

1.1.1 糞便樣品 從國家實驗獼猴基地采集老年（2只）、青年（2只）和幼年（2只）獼猴的新鮮糞便各2份。1.1.2 主要儀器 臺式離心機，分光光度計，核酸蛋白檢測儀，PCR擴增儀，BIO-RAD凝膠成像系統，FR-180A電泳槽，電熱恒溫水浴鍋。

1.1.3 主要試劑 無菌PBS緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.4），TE buffer，丙酮，含溶菌酶的TE（溶菌酶濃度20mg/mL），消化緩沖液，無水乙醇，蛋白酶K，洗液，洗脫緩沖液，10×Buffer，dNTP，上下游引物，TaqDNA聚合酶，DNA模板，雙蒸水，MgCl2。

2 試驗方法

2.1 糞便采集 采集3個年齡段獼猴的糞便各2份，每份標本濕重約4g，收集到無菌塑料袋置于冰盒中，迅速帶入實驗室-20℃保存備用。

2.2 糞便標本預處理 將每份糞便標本分成均勻的3份，分別加入裝有6 mL無菌PBS緩沖液的試管中，充分振蕩5～10min，500r/min離心5 min，收集上清液。此步驟重復3次。然后取上清液以5000 r/min離心10min，收集沉淀置于Eppendorf管中。沉淀物在1mL TE buffer中懸置，混合后以14 000 r/min離心5min，收集沉淀。將沉淀溶于200μL丙酮中（-20℃預冷），振蕩混勻，14000r/min離心2min，棄上清。此步驟重復3次。最后將細菌溶于TE buffer中，混勻，分別標上記號，-20℃保存備用。

2.3 細菌基因組提取

2.3.1 反復凍融法[1]在預處理好的樣品中加入660 μL TE緩沖液（pH 7.2），充分振蕩混勻，-20℃冰凍1h，取出，迅速于65℃溫浴30min，反復3次。然后加入75μL的SDS（10%）和12.5μL的蛋白酶K（20mg/mL），37℃溫浴2h，最后進行酚-氯仿抽提。

2.3.2 酶裂解法[2]在預處理好的樣品中加入200μL裂解液I（50 mmol/L Tris-base+50 mmol/L Na2EDTA，pH 7.8）和50μL的溶菌酶（50mg/mL），37℃溫浴1h，每隔20min輕輕倒置混勻。然后加入500μL的裂解液Ⅱ（200mmol/L NaCl+100mmol/L Tris2-base+50 mmol/L Na2EDTA+2.0%SDS+1.0%Triton X2100）和12.5 μL的蛋白酶K（20mg/mL），37℃溫浴12h，最后進行酚-氯仿抽提[3]。

2.3.3 試劑盒法[4]在預處理好的標本中加200μL含溶菌酶的TE，用移液尖混勻。室溫下孵育40min，加入試劑盒中提供的消化緩沖液400μL，混勻；再加入3μL蛋白酶K，混勻后55℃保溫2～3h；加入260μL無水乙醇，混勻后用移液尖將樣品全部轉移至UNIQ-10柱中，8000r/min離心1min；取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的廢液，將柱放回收集管中，加入500μL洗液，10000r/min離心30s。此步驟重復兩次。取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的全部廢液；將柱放回收集管中，10000r/min室溫離心1 min，以除去殘留洗液，將柱放入新的Eppendorf管中，在柱中央加入50μL洗脫緩沖液，室溫或37℃放置2min；室溫下10000r/min離心1min，離心管中收集的液體即為細菌基因組DNA。

2.4 腸道菌群總DNA質量檢測 各取7μL用以上3種方法抽提的青年組DNA，分別作上標記，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在凝膠成像儀上觀察分析[5]。各取30μL青年組DNA樣品稀釋100倍，用分光光度計檢測總DNA的A260、A280和A260/A280值，同時用核酸蛋白檢測儀檢測DNA樣品的濃度值。

2.5 ERIC-PCR擴增 引物序列：應用通用引物進行擴增。上游引物序列ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCC CTGGGGAATCCA-3′，下游引物序列ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGATGCG-3′。這對通用引物可擴增近全長的細菌ERIC序列。擴增體系：10× PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.5μL，MgCl21.5μL，上下游引物各1 μL，Taq酶0.2 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O將反應體積補至25μL。反應條件：95℃預變性5min，94℃變性1min，52℃退火1 min，65℃延伸8min，循環30次，最后65℃延伸12min。

2.6 ERIC-PCR產物分析 取6μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，瓊脂糖濃度為1%，EB染色，用凝膠成像儀觀察拍照，記錄結果[6]。

3 結果與分析

3.1 總DNA的濃度和純度檢測 用反復凍融法得到的2份青年組樣品DNA提取物經瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），結果顯示：獲得的DNA片段完整，不存在降解現象，但所提取的DNA條帶亮度較低，清晰度較差。

用酶裂解法得到的2份青年組樣品DNA提取物經瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），結果顯示：所得到的DNA片段完整，不存在降解現象，且提取的DNA條帶很清晰，亮度高。

用試劑盒法得到的2份青年組樣品DNA提取物經瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），結果顯示：所得到的DNA片段完整，不存在降解現象，且提取的DNA條帶很清晰，亮度高。

圖1 3種方法提取的樣品DNA經瓊脂糖凝膠電泳得出的結果

用分光光度計檢測的結果見表1。由表1可以看出，用3種方法提取的青年組獼猴腸道菌群總DNA中，反復凍融法的濃度最低，而酶裂解法和試劑盒法的濃度較高，但3種方法提取的總DNA的A260/A280值均介于1.6～1.9之間，且同組的結果差異不大，說明用這3種方法提取DNA的污染小，重復性較好，與電泳結果一致。

表1 3種方法提取的DNA濃度值和純度值比較 μg/μL

隨機選擇青年組的2個樣品分別用3種方法進行DNA提取，確定最佳的DNA提取方法。最終得出酶裂解法和試劑盒法均能提取較好質量的DNA，綜合選定酶裂解法。

3.2 ERIC-PCR產物分析 將酶裂解法得到的幼年（2份）、青年（2份）、老年（2份）組獼猴腸道菌群總DNA進行ERIC-PCR分析（其擴增產物的電泳結果見圖2）。圖譜上的泳帶反映了糞樣中的優勢菌群，亮度表明了腸道菌群DNA的豐度，泳帶數量和位置的復雜性說明了菌群的多樣性。由圖2可知，同年齡組的泳帶數量和位置變化很小；幼年獼猴糞便樣品的條帶數較為豐富，表明此時已有較多菌群在腸道內定植；青年獼猴糞便樣品與幼年獼猴相比，無論是ERIC條帶的數量還是位置都發生了較為明顯的改變；老年獼猴糞樣中的條帶數最少，說明腸道菌群種類最少。

4 討論與分析

1987年之前，對生態系統中微生物群體的多樣性以及群落結構的分析大多是將微生物進行分離培養，然后通過一般生理生化性狀，或者特定的表型來進行分析。以上方法都是局限于從培養基上分離到的微生物。目前，腸道中許多細菌還不能用現有的培養手段獲得，純培養日益顯現出局限性。因而通過直接從糞便中提取細菌總DNA，然后利用ERIC-PCR方法對微生物的多樣性進行研究，避免了細菌培養這一步，從而可以對微生物群體的全貌加以研究。ERIC-PCR廣泛用于細菌的鑒定、分子分類等研究。

圖2 3個年齡段獼猴腸道菌群DNA的ERIC-PCR擴增結果

本文研究的3種方法均能夠得到質量較高的總DNA，但是反復凍融法所提DNA的條帶亮度都比較低，清晰度差，DNA濃度明顯低于其他2種方法。最終我們選擇酶裂解法是因為酶裂解法和試劑盒法提取的細菌DNA濃度和純度都很高，效果差不多，但是試劑盒法所需要的實驗操作較復雜且成本較高[7]。

本文采用ERIC-PCR技術分析了3個不同年齡段獼猴的菌群結構的變化和特點，并結合相似性分析比較了獼猴個體菌群的多樣性。結果表明，老年動物的優勢條帶少，青年動物的優勢條帶多，幼年動物的優勢條帶次于青年動物。相同年齡組獼猴腸道菌群組成差異不大，優勢菌群也有一定差別；不同年齡組獼猴腸道菌群組成差異較大，青年組菌群種類最多，老年組菌群種類最少。相對而言，幼年獼猴腸道微生物區系很不穩定，食物和環境的改變均可導致其微生物菌群的不平衡；青年獼猴腸道優勢菌群較多，微生物系統已經比較穩定了；老年獼猴腸道優勢菌群最少，說明其腸道微生物系統已逐漸退化，不能滿足對營養的全面吸收。以上只是ERIC-RCR的初步分析結論，因為同一個大小的DNA片段往往包含有多個條帶，如要進行進一步的分析則還需要通過其他方式，如DGGE和測序等。

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