甘草甜素對人食管癌細(xì)胞ECA109的影響及機(jī)制

梁 嵐 張 潔

(攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)整合醫(yī)學(xué)教研室，四川 攀枝花 617000)

我國食管癌的發(fā)病率及死亡率高居世界首位。由于食管癌患者的早期臨床癥狀輕微不明顯，導(dǎo)致大部分患者因進(jìn)行性吞咽困難等典型癥狀就醫(yī)時(shí)已經(jīng)喪失手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。而化療則成為了臨床上治療食管癌的重要方法。但其治療效果往往不理想，患者預(yù)后較差。甘草甜素是從甘草中分離提取的三萜類成分〔1，2〕，對多種惡性腫瘤，如肝癌〔3〕、乳腺癌〔4〕等有抗腫瘤的活性，但是還未見甘草甜素在食管癌中的報(bào)道。本研究觀察不同濃度甘草甜素對食管癌細(xì)胞株(ECA109)的增殖、凋亡及周期的影響，并在分子水平上對可能的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1材料 人食管癌細(xì)胞株ECA109由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞所提供。甘草甜素(MDL 號：MFCD00065194，經(jīng)HPLC測定，純度≥99.6%)；兔抗bcl-2單克隆抗體、鼠抗bax單克隆抗體、兔抗p53單克隆抗體、兔抗GAPDH(美國Santa公司)；辣根酶過氧化物標(biāo)記的二抗購自美國Santa Cruz公司，Trizol Reagent購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和cDNA擴(kuò)增試劑盒均購自thermo公司，CCK8試劑盒，凋亡試劑盒，周期試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌細(xì)胞株ECA109使用含10%血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、95%相對濕度條件培養(yǎng)。采用甘草甜素處理的細(xì)胞設(shè)定為實(shí)驗(yàn)組，甘草甜素未處理的細(xì)胞設(shè)定為對照組。

1.2.2CCK8檢測食管癌細(xì)胞的增殖情況 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量控制在5 000個(gè)/孔，5個(gè)復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)放置24 h。待細(xì)胞貼壁后，對照組中加入不含甘草甜素1%血清的DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中分別加入含12.5，25.0，50.0，100.0，200.0，400.0 μmol/L甘草甜素的1%血清的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔中加入10 μl的CCK8于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，以不含細(xì)胞和甘草甜素作為實(shí)驗(yàn)的空白對照組。于酶標(biāo)儀(BIO-RAD680)上檢測450 nm波長處各組的吸光度值并計(jì)算IC50值。細(xì)胞抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白對照組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測食管癌細(xì)胞的凋亡情況 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后以5×105個(gè)/ml均勻接種于6孔板中，待24 h細(xì)胞貼壁后，對照組和實(shí)驗(yàn)組中分別加入不含甘草甜素的培養(yǎng)基和含200 μmol/L 甘草甜素的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h。PBS清洗兩次，消化收集各組細(xì)胞加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸，依次加入Annexin-V，PI各5 μl。于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀(BD FACSCanto Ⅱ)上檢測，用Cell Quest軟件檢測并分析細(xì)胞凋亡和死亡情況。結(jié)果判定：異硫氰酸熒光素(FITC-)/碘化丙啶(PI-)為活細(xì)胞，F(xiàn)ITC-/PI+為壞死細(xì)胞，F(xiàn)ITC+/PI-為早期凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC+/PI+為晚期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率/%=(早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù))/全部細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測食管癌細(xì)胞的周期情況 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后以5×105個(gè)/ml均勻接種于6孔板中，待24 h細(xì)胞貼壁后，對照組和實(shí)驗(yàn)組中分別加入不含甘草甜素的培養(yǎng)基和含200 μmol/L甘草甜素的培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h。PBS清洗兩次，加入含75%乙醇的1×結(jié)合緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×105個(gè)/ml，4℃固定12 h以上。固定完后收集細(xì)胞加入RNaseA反應(yīng)30 min，5 μl PI室溫避光反應(yīng)20 min。于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測，按Cell Quest軟件檢測并分析細(xì)胞周期情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2.5RT-PCR檢測食管癌細(xì)胞中mRNA的表達(dá) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將試驗(yàn)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入含50 μmol/L和200 μmol/L 甘草甜素的10%血清DMEM高糖培養(yǎng)基，對照組加入不含甘草甜素的10%血清DMEM高糖培養(yǎng)基。處理24 h后按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞中的RNA，將細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后擴(kuò)增成DNA(所有步驟嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒說明書操作)。bax引物序列，上游：5′-TGTCTGTCTTGTCCCCTTCC-3′，下游：5′-ACCTTGAGCACCAGTTTGCT-3′；bcl-2上游：5′-TCCATGTCTTTGGACAACCA-3′，下游：5′-CTCCACCAGTGTTCCCATCT-3′；p53上游：5′-CCCTCTACAACATCACCACG-3′，下游：5′-TCCCTTTCAGCAGGTCAGA-3′；以GAPDH作為內(nèi)參，上游：5′-CATGGGGTGTGAACCATGAGA-3′；下游：5′-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。所有引物序列均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。RT-PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min，然后95℃變形30 s，50℃退火30 s，70℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，最后70℃延伸10 min結(jié)束。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)測條帶灰度，以目的基因與內(nèi)參基因GAPDH灰度值的比值反映目的基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2.6Western印跡檢測食管癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將試驗(yàn)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入含50 μmol/L和200 μmol/L 甘草甜素的10%血清DMEM高糖培養(yǎng)基，對照組加入不含甘草甜素的10%血清DMEM高糖培養(yǎng)基。處理24 h后按照RAPI裂解液說明書提取細(xì)胞中的總蛋白。采用BSA法定量細(xì)胞總蛋白。采用12%SDS-PAGE電泳2 h分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜，PBS清洗后加入二抗〔IgG(1∶2 000)〕，37℃孵育2 h，最后電化學(xué)發(fā)光顯影后用凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)測蛋白條帶光密度值。本實(shí)驗(yàn)選用GAPDH作為內(nèi)參對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

2 結(jié) 果

2.1甘草甜素對食管癌細(xì)胞增殖的影響 隨著甘草甜素處理時(shí)間的延長和處理濃度的增加，甘草甜素對食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增加，具有時(shí)間-劑量依賴性。食管癌細(xì)胞在相同劑量甘草甜素不同處理時(shí)間的細(xì)胞抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同劑量甘草甜素處理相同時(shí)間的細(xì)胞抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。甘草甜素作用于食管癌細(xì)胞24、48、72 h的IC50值分別為187.34 μmol/L，98.25 μmol/L和69.21 μmol/L。

表1 不同濃度甘草甜素處理不同時(shí)間后食管癌細(xì)胞的抑制率比較

2.2甘草甜素對食管癌細(xì)胞凋亡的影響 與對照組〔細(xì)胞凋亡率(8.69±0.91)%〕相比，50.0 μmol/L〔凋亡率(22.74±1.85)%〕與200.0 μmol/L〔凋亡率(47.29±3.21%)〕濃度的甘草甜素處理后的食管癌細(xì)胞的凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.987,P=0.004；t=14.732,P=0.000)。

2.3甘草甜素對食管癌細(xì)胞周期的影響 通過流式細(xì)胞儀檢測不同濃度甘草甜素處理食管癌細(xì)胞24 h后DNA含量分析，結(jié)果顯示，與對照組相比，50.0 μmol/L與200.0 μmol/L濃度的甘草甜素能明顯阻滯細(xì)胞在G1期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.032,P=0.003；t=8.752,P=0.002)。見表2。

2.4甘草甜素對食管癌細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響 隨著甘草甜素處理濃度的增加，食管癌細(xì)胞中bax與p53的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而bcl-2的mRNA表達(dá)隨著甘草甜素處理濃度的增加而降低(P<0.05)。見圖1，表3。

表2 甘草甜素對食管癌細(xì)胞的周期影響情況

與對照組比較：1)P<0.05

圖1 甘草甜素對食管癌細(xì)胞中bcl-2，bax，p53 mRNA表達(dá)的影響

表3 甘草甜素對食管癌細(xì)胞中bcl-2，bax，p53 mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與50.0 μmol/L比較：2)P<0.05，下表同

2.5甘草甜素對食管癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 隨著甘草甜素處理濃度的增加，食管癌細(xì)胞中bax與p53蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而bcl-2 蛋白的表達(dá)隨著甘草甜素處理濃度的增加而降低(P<0.05)。隨著甘草甜素處理濃度的增加，食管癌細(xì)胞中bax/bcl-2的比例逐漸增加(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 甘草甜素對食管癌細(xì)胞中bcl-2，bax，p53蛋白表達(dá)的影響

表4 甘草甜素對食管癌細(xì)胞中bcl-2，bax，p53蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

目前治療食管癌的手段還是首選手術(shù)切除，但是由于食管癌的具有高侵襲、高轉(zhuǎn)移的生長特性導(dǎo)致患者治療效果和預(yù)后不佳。所以化療成為食管癌主要的治療手段〔5〕。

研究顯示，中醫(yī)藥能夠在宏觀上對機(jī)體起到調(diào)節(jié)作用，在病情的延緩，控制和防止復(fù)發(fā)等方面有很好的療效〔6〕。甘草甜素是甘草中最重要的生物活性物質(zhì)，主要存在于甘草根表皮以內(nèi)的部位，其廣泛的抗腫瘤活性主要體現(xiàn)為增強(qiáng)外周血單個(gè)細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子的作用，在體內(nèi)也可以增強(qiáng)機(jī)體自然殺傷(NK)細(xì)胞和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)的毒性活力〔7,8〕。研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素能夠抑制人胃癌細(xì)胞KATOIII和白血病細(xì)胞HL-60的增殖，并且抑制作用隨著作用時(shí)間的延長和作用強(qiáng)度的增加而增加〔9〕。而在體外實(shí)驗(yàn)中Shiota等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素能夠抑制肝癌的生長。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素對前列腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞有抑制的作用〔3,11〕。而本研究結(jié)果提示甘草甜素對ECA109細(xì)胞的增殖能力的影響具有時(shí)間-劑量的依賴性，與有關(guān)研究報(bào)道一致〔12〕。

細(xì)胞周期的進(jìn)程阻滯與凋亡的受阻是腫瘤細(xì)胞無限增殖的原因之一。有研究發(fā)現(xiàn)，甘草甜素具有誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞SW-1116凋亡的作用，并且與甘草甜素作用的濃度和時(shí)間呈正相關(guān)，同時(shí)甘草甜素能夠?qū)W-1116細(xì)胞明顯阻滯在G1期〔3〕。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測50.0 μmol/L和200.0 μmol/L濃度甘草甜素作用于食管癌細(xì)胞ECA109時(shí)的周期和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)各組濃度的甘草甜素處理后的細(xì)胞周期和凋亡與對照組均發(fā)生了明顯的改變；50.0 μmol/L和200.0 μmol/L甘草甜素作用后的ECA109細(xì)胞周期被明顯阻滯于G1期，凋亡率也明顯增加。這可能是甘草甜素延長細(xì)胞G1期時(shí)間而抑制細(xì)胞增殖，但是具體的機(jī)制還不清楚。

Bcl-2家族基因與p53基因都是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因。bcl-2與bax是Bcl-2家族中最具代表性的兩種基因，分別起著抑制凋亡與促進(jìn)凋亡的作用〔13〕。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)bcl-2相對占優(yōu)勢時(shí)，bcl-2將會(huì)與bax形成異源二聚體導(dǎo)致凋亡受到抑制；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)bax占據(jù)優(yōu)勢時(shí)，bax本身形成同源二聚體促進(jìn)凋亡的發(fā)生〔14〕。因此bax/bcl-2的比值對于細(xì)胞進(jìn)入凋亡與否及凋亡程度有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素作用食管癌細(xì)胞24 h后，隨著濃度的增加，細(xì)胞中bcl-2的表達(dá)呈降低的趨勢，而bax的表達(dá)逐漸增高，并且bax/bcl-2的比例也逐漸增加，提示甘草甜素通過上調(diào)促進(jìn)凋亡的bax基因，使bax本身形成同源二聚體，加速細(xì)胞的凋亡。野生型p53是一種促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因，可以通過多種途徑激活下游的促凋亡基因誘發(fā)細(xì)胞的凋亡〔15〕。有研究發(fā)現(xiàn)在p53突變的乳腺癌細(xì)胞中，苯乙雙胍對細(xì)胞的促凋亡作用受到抑制，而當(dāng)乳腺癌細(xì)胞中突變型的p53恢復(fù)至野生型時(shí)，苯乙雙胍對細(xì)胞的促凋亡作用得到加強(qiáng)，提示p53在藥物的抗腫瘤方面發(fā)揮著重要的作用〔16〕。本研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素作用24 h后的食管癌細(xì)胞中p53的表達(dá)明顯增加，并隨著濃度增加而增加，提示甘草甜素可能通過上調(diào)食管癌細(xì)胞中p53的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，甘草甜素能夠延長細(xì)胞G1期時(shí)間而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，可能通過調(diào)控bax，bcl-2及p53多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，提示甘草甜素有可能作為一種新型的輔助用藥用于食管癌的治療，為臨床上食管癌的治療提供新的依據(jù)與參考。

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