siRNA下調S100A4基因表達對人膠質瘤U251細胞增殖和凋亡的影響

沈 薇 隋 璐 湯曉琳 呂 鑫

(沈陽醫學院病理生理教研室，遼寧 沈陽 110034)

膠質瘤約占大腦及神經系統惡性腫瘤的45%，且大多數呈惡性發展，預后不理想〔1〕。研究證實，膠質瘤具有細胞異常增殖、細胞凋亡減慢等生物學特性，使膠質瘤的治療面臨巨大困難〔2〕。S100A4蛋白通過調節細胞存活，運動和侵襲在多種腫瘤發生發展中發揮生物學功能。有報道S100A4對膠質瘤細胞的侵襲、遷移起促進作用〔3〕，但對膠質瘤細胞生長及凋亡特性的影響目前尚不清楚。本研究利用RNA干擾(RNAi)技術抑制S100A4表達，觀察下調S100A4表達對人膠質瘤細胞U251增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 人膠質瘤U251細胞株購自中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。siRNA-S100A4序列5'-CGAGGUGGACUUCCAAGAGTT-3'，陰性對照(siRNA-NC)序列5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'購自上海吉瑪公司。RPMI1640培養基購自Gibco公司，總RNA提取試劑盒，RT-PCR試劑盒，GoTaq Master Mix購自美國Promega公司，細胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK-8)，AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒購自東仁化學科技公司。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3檢測試劑盒購自凱基生物公司。轉染試劑lipofectamineTM2000,電化學發光(ECL)試劑盒分別購自美國Invitrogen 公司和Pierce公司。兔抗人S100A4抗體購自美國Lab Vision公司。鼠抗人β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2細胞培養和siRNA瞬時轉染 U251細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5%CO2飽和濕度條件下常規培養。將處于對數生長期的U251細胞接種到6孔板中，次日進行轉染。實驗分正常對照組(細胞未經任何處理)、陰性對照組(轉染siRNA-NC)和siRNA-S100A4轉染組。按照lipofectamineTM2000說明書進行細胞轉染。

1.3RT-PCR 檢測S100A4 mRNA表達水平 提取轉染48 h后3組細胞的總RNA,RNA逆轉錄成cDNA和RT-PCR擴增。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參照。S100A4上游引物：5'-CCCTGGATGTGATGGTGTC-3'，下游引物：5'-CTCGTTGTCCCTGTTGCTG-3'；GAPDH上游引物：5'-CCCTTCATTGACCTCAACTA-3'，下游引物：5'-CCAAAGTTGTCATGGATGAC-3'。擴增體系20 μl。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s和72℃ 30 s，共40個循環。應用2-△△CT法計算CT值。各組均設3個復孔，重復實驗3次。

1.4Western印跡檢測S100A4 蛋白表達 收集轉染48 h后3組細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白含量。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質，濕轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，分別加入S100A4抗體(1∶1 000)、β-actin抗 體(1∶2 000)4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗10 min，共3次；加入相應二抗(1∶2 000)37℃孵育2 h。TBST溶液漂洗10 min，共3次。ECL化學發光劑孵育，Bio-Rad凝膠成像系統采集圖片并進行灰度值分析。

1.5CCK-8檢測細胞增殖變化 將各組細胞按1 500/孔接種96孔板，每組設3個復孔，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細胞培養箱內孵育4 h，測定A450 nm波長OD值，連測3 d，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。以上實驗重復3次。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡率變化 轉染48 h后，用胰酶消化各組細胞，制成單細胞懸液，再用PBS離心洗滌，調整待測細胞密度為1×106個/ml。1 000 r/min,4℃離心10 min，收集細胞，棄上清液，PBS重懸，再次1 000 r/min,4℃離心10 min。100 μl結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC和10 μl PI混勻，避光孵育15 min后，加入400 μl結合緩沖液，流式細胞儀檢測分析。

1.7細胞內caspase-3活性檢測 轉染48 h后，收集3組細胞，按試劑盒說明操作，加入裂解緩沖液，10 000 r/min,4℃離心1 min，取上清加入反應緩沖液和caspase-3基底，37℃ 避光孵育4 h后，用酶標儀在405 nm波長下讀取吸光值(A值)。caspase-3活性單位(U)=A實驗組/A對照組×100% 。實驗重復3次。

1.8統計學方法 應用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1轉染siRNA后S100A4 mRNA和蛋白表達 轉染48 h后，RT-PCR結果顯示，設正常對照組為1，siRNA-S100A4組S100A4 mRNA表達(0.23±0.06)顯著低于正常對照組和陰性對照組(0.93±0.04，P<0.01)。Western印跡檢測顯示，正常對照組、陰性對照組、siRNA-S100A4組灰度比值分別為1.05 ± 0.11、1.02±0.09、0.46±0.10。siRNA-S100A4組S100A4蛋白表達顯著低于正常對照組和陰性對照組(P<0.01)。見圖1。

2.2S100A4 siRNA對U251細胞增殖的影響 在轉染后第1～3天分別收集細胞，CCK-8檢測發現轉染48、72 h后，與正常對照組和陰性對照組比較，siRNA-S100A4組細胞生長明顯受到抑制，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 Western印跡檢測S100A4蛋白表達

圖2 S100A4表達下調對U251細胞增殖的影響

2.3S100A4 siRNA對U251細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果表明，轉染48 h后，siRNA-S100A4組細胞凋亡率(27.48%±1.96%)顯著高于正常對照組(8.54%±2.68%)和陰性對照組(11.95%±2.28%，P<0.05)。

2.4S100A4 siRNA對U251細胞caspase-3活性的影響 U251細胞轉染48 h后，設正常對照組為100%，siRNA-S100A4組caspase-3酶活性(357.40%±48.42%)顯著高于正常對照組和陰性對照組(138.73%±17.11%，P<0.01)。

3 討 論

S100A4是S100蛋白家族成員之一，一般以同源二聚體或異二聚體形式存在于細胞內，具有調節血管生成、細胞存活、細胞運動和侵襲等廣泛的生物學功能。研究表明，S100A4的表達與胃癌、乳腺癌、喉癌等多種腫瘤的預后有密切聯系〔4～6〕。2008年Harris等〔7〕首次發現S100A4 在大鼠腦膠質瘤干細胞中有豐富的表達。研究報道證實，S100A4通過促進膠質瘤細胞的侵襲、轉移參與神經膠質瘤的發生發展〔3〕。除了侵襲轉移，膠質瘤細胞同時具有無限復制潛能，逃避凋亡等惡性生物學特性，分子靶向抑制其增殖，促進凋亡的特性。

腫瘤細胞過度增殖促使腫瘤生長迅速，成為腫瘤發生最突出的特征之一。本研究結果提示，采用siRNA下調S100A4表達可以抑制膠質瘤細胞的增殖。S100A4在腫瘤的增殖過程中起重要促進作用。有報道S100A4 siRNA轉染喉癌細胞能有效抑制細胞增殖，降低裸鼠體內成瘤能力〔6〕。本研究結果與之一致，提示沉默S100A4表達能夠抑制膠質癌細胞的生長、增殖。細胞凋亡在腫瘤發生發展中起重要作用。本實驗結果提示，siRNA下調S100A4表達可明顯增加膠質瘤細胞的凋亡。與S100A4 siRNA在其他腫瘤中促凋亡的作用類似，Hua等〔4〕報道RNAi沉默S100A4基因促進胃癌BGC823細胞凋亡。Mahon等〔8〕證實S100A4 siRNA誘導胰腺癌細胞凋亡。caspase家族在調控細胞凋亡中發揮重要作用。其中caspase-3是關鍵激酶之一。Mahon等〔8〕報道敲除S100A4可通過激活caspase-3，多聚ADP-核糖聚合酶誘導細胞凋亡。本研究結果提示，S100A4 siRNA通過活化caspase-3促進膠質瘤細胞的凋亡。S100A4可能是膠質瘤發生發展中的重要癌基因，在轉錄后水平特異性抑制S100A4基因的表達，可能成為膠質瘤治療的新靶點。

1Stupp R,Mason WP,van den Bent MJ,etal.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma〔J〕.N Engl J Med,2005;52(10):987-96.

2Tahara S,Nojima S,Ohshima K,etal.S100A4 accelerates the proliferation and invasion of endometrioid carcinoma and is associated with the "MELF" pattern〔J〕.Cancer Sci,2016;107(9):1345-52.

3趙鵬飛，楊學軍，張 辰，等.敲低S100A4表達對膠質瘤細胞系SNB19侵襲和遷移的影響〔J〕.中國神經精神疾病雜志,2014;40(12):746-51.

4Hua J,Chen D,Fu H,etal.Short hairpin RNA-mediated inhibition of S100A4 promotes apoptosis and suppresses proliferation of BGC823 gastric cancer cells in vitro and in vivo〔J〕.Cancer Lett,2010;292(1):41-7.

5Egeland EV,Boye K,Park D,etal.Prognostic significance of S100A4-expression and subcellular localization in early-stage breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2017;162(1):127-37.

6Liu J,Fu S,Xu Y,etal.RNA interference targeting inhibition of S100A4 suppresses cell growth and promotes apoptosis in human laryngeal carcinoma Hep 2 cells〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(3):1389-94.

7Harris MA,Yang H,Low BE,etal.Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma〔J〕.Cancer Res,2008;68(24):10051-9.

8Mahon PC,Baril P,Bhakta V,etal.S100A4 contributes to the suppression of BNIP3 expression,chemoresistance,and inhibition of apoptosis in pancreatic cancer〔J〕.Cancer Res,2007;67(14):6786-95.