重組腺病毒p21轉染人毛乳頭細胞的模型構建

張國強 易 娟 趙 璐 程 毅 高順強

(河北醫科大學第四醫院皮膚科，河北 石家莊 050011)

人毛乳頭細胞(HDPCs)具有一定的毛發誘導能力〔1〕，對毛發生長及周期循環起到至關重要的作用。而體外培養的DPCs呈現凝集性生長是其主要生物學特性之一〔2〕，這可能和細胞衰老有關。p21(又名細胞周期蛋白激酶抑制因子，CDKN1A)是眾多衰老相關基因之一〔3〕，參與調節細胞衰老的許多過程。本實驗擬以腺病毒rAd5-CDKN1A成功轉染DPCs，沉默DPCs中p21基因，確定轉染的轉染效率及最佳滴度，以進一步研究p21基因對DPCs生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑 HDPCs(貨號：2400，批號：9640)購自美國ScienCell公司，間充質干細胞(MSCM)培養基(貨號：7501，批號11626)購自美國 ScienCell公司，腺病毒rAd5-CDKN1A-1p2 shRNA(批號：13079)和rAd5-HKshRNA-EGFP(批號：130725-3)購自武漢淅瑪生物有限公司，兔抗人p21單克隆抗體(貨號：2990-1，批號:YJ102911CS)購自 EPITOMICS公司，總RNA抽提試劑盒(Trizol)購自Solarbio公司，莫洛尼質鼠白血病病毒(M-MLV)反轉錄試劑盒(批號8213068)及聚合酶鏈反應(PCR)擴增試劑盒(批號8211212)均購自Invitrogen公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2倒置熒光顯微鏡下測定rAd5-CDKN1A對DPCs轉染效率 取對數生長期生長狀態較好的DPCs，制成單細胞懸液后以每孔1×105個/ml的濃度接種于2個6孔板中，待細胞完全貼壁后，分別用rAd5-CDKN1A病毒液轉染DPCs，感染系數(MOI)分別為0、25、50、200、500〔4〕,于48 h后熒光顯微鏡下每孔分別隨機選擇3個200倍視野計數呈現綠色熒光蛋白(GFP)陽性細胞數，并在明場中計數該視野內細胞總數，計算轉染率(轉染率=GFP陽性細胞數/明場下該視野內總細胞數)。

1.33-(4,5-二甲基噻噻-2)-2,5二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測不同濃度rAd5-CDKN1A和rAd5-HK下DPCs的增殖效率 取對數生長期生長狀態良好的DPCs制成單細胞懸液，以每孔按1×105個/ml的濃度接種于96孔板。代細胞完全貼壁后，按MOI值為0、25、50、100、200、500加入腺病毒，并設置相應MOI值組，其中以完全培養液為空白對照，每組設立6個平行孔，分別于指定時間(24、48、72、96、120、144 h)棄去培養液，用MTT的方法進行檢測，計算細胞增殖效率。

1.4RT-PCR方法檢測rAd5-CDKN1A和rAd5-HK轉染DPCs后p21基因的表達 收集生長良好的DPCs，按MOI=100分別轉染rAd5-CDKN1A和rAd5-HK入DPCs，并收集相應細胞提取mRNA，按M-MLV反轉錄試劑盒和PCR擴增試劑盒說明進行反轉錄和RT-PCT擴增，其中p21引物由Invitrogen公司合成，引物A：5'-ATTCAGCATTGTGGGAGGAG-3'，引物B：5'-TGGACTGTTTTCTCTCGGCT-3'，β-actin 引物也由Invitrogen公司合成，引物A：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，引物B：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。于PCR Pχ2Thermal Cycler機子上設置循環程序為95℃，30 s；47℃，30 s；72℃，20 s；35個循環。之后再以1.5%瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測p21基因表達，用凝膠成像分析系統分析電泳結果。

1.5統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗，χ2檢驗，單因素方差分析。

2 結 果

2.1rAd5-CDKN1A和rAd5-HK對DPCs的轉染效率 DPCs細胞對腺病毒較敏感，隨著MOI的增加，染色陽性率也增加。當MOI取值為0、25、50、100、200和500時，轉染效率分別為0、(15.2±2.64)%、(44.3±3.95)%、(95.2±1.06)%、(97.5±1.07)%和(98.9±0.67)%。MOI為0、25、50及100組中各組間差異有統計學意義(P<0.05)，而MOI為100、200和500組間差異無統計學意義(P>0.05)；MOI為0、25、50和100組顯示腺病毒的轉染效率與病毒濃度呈明顯正相關(r=0.967，P<0.01；Y=0.978 1，X-4.126 7)，然而隨著病毒濃度的進一步增加，即MOI值為100、200和500時，轉染效率升高不明顯(r=0.382，P>0.05)。此外，于MOI=200和MOI=500組的視野中，可見小部分細胞漂浮，且MOI=500組細胞漂浮較多，見圖1。

圖1 不同MOI值的重組腺病毒rAd5-CDKN1A shRNA轉染DPCs GFP的觀察結果(×200)

2.2rAd5-CDKN1A轉染DPCs對細胞增殖抑制的影響 隨著腺病毒rAd5-CDKN1A濃度增加，各實驗組與相同時間點對照組相比，細胞增殖逐漸受到抑制，其中，MOI=200及MOI=500組對DPCs細胞的增殖抑制效果明顯；而MOI=100組對DPCs細胞的增殖促進效果顯著(P<0.05)，MOI=25和MOI=50組對DPCs細胞增殖無明顯作用，見圖2。

圖2 不同MOI值下DPCs的生長曲線

2.3rAd5-CDKN1A轉染DPCs對細胞內p21基因mRNA表達的影響 以MOI=100為理想滴度將rAd5-CDKN1A shRNA和rAd5-HK shRNA導入DPCs中，并提取相應RNA進行反轉錄、RT-PCR擴增及凝膠電泳分析(以正常細胞為基準，將轉染rAd5-HK shRNA的細胞作為空載體對照)。發現rAd5-CDKN1AshRNA處理后的DPCs中p21基因條帶明顯暗于正常細胞和轉染rAd5-HK shRNA的細胞，見圖3。

1：rAd5-CDKN1A shRNA,2:rAd5-HK shRNA,3:正常細胞圖3 正常細胞、轉染rAd5-HK shRNA和rAd5-CDKN1A shRNA細胞中P21基因表達

3 討 論

DPCs位于毛囊基底部，具有毛發誘導能力，可誘導毛囊形成并在毛發生長、周期性循環及再生中發揮主導作用〔5,6〕。此外，體外培養早期DPCs展現出凝集性生長特性，但體外培養高代次DPCs并不展現這一特性，反而出現生長抑制。有學者認為DPCs凝集性生長特性可能與DPCs的生物學功能有關〔7〕。高代次DPCs逐漸喪失凝集性生長特性可能與細胞衰老有關。而細胞衰老是由細胞周期蛋白激酶抑制因子調控，其中，細胞周期蛋白激酶抑制劑p21也是一種抑癌基因，其在預防腫瘤的發展中起到至關重要的作用，并對細胞衰老起到一定的調控作用。

腺病毒主要是通過細胞表面的特異性受體柯薩奇病毒受體進入細胞，不同類型細胞對腺病毒易感性不同，其易感能力取決于細胞表面作用受體數目的多少〔4〕。腺病毒早期基因(E1)缺失的腺病毒載體本身沒有復制能力，但當劑量過大或轉染時間過長時，腺病毒對感染細胞卻有一定的毒性〔4〕。這限制了目的基因表達的時間和水平，因此，在涉及腺病毒轉染的體內外實驗研究中，確定最佳MOI便是所有實驗最重要的前提。腺病毒細胞毒性與MOI感染時間呈明顯的對應關系〔4,8〕，尤其是MOI達到500以上時，細胞毒性和目的基因表達下降都有明顯的表現，但MOI低于50時，腺病毒對細胞增殖無明顯影響〔4,9〕。相關文獻指出，異常超表達的p21可引起細胞生長阻滯，且基因沉默p21大都對細胞增殖有促進作用〔10〕。而另一方面，腺病毒本身對細胞有一定的毒副作用，轉染過程中，腺病毒的進入對細胞也是一種外源性刺激，可能引起細胞一系列的干擾反應，使細胞停滯，生理特性發生改變如部分細胞漂浮等。因此，在腺病毒滴度不合適時，轉染rAd5-CDKN1A對DPCs的作用可能主要是干擾反應，合適滴度的rAd5-CDKN1A才有可能體現出沉默目的基因p21的作用。細胞部分漂浮可能是由于病毒滴度較大，產生的毒素較多，影響細胞生長狀態造成。MTT法繪制轉染后DPCs的增殖曲線提示rAd5-CDKN1A對DPCs的增殖有促進作用，符合相關文獻中p21沉默往往促進細胞增殖的報道〔10〕。基于腺病毒轉染的細胞毒副作用及促進細胞增殖兩方面考慮，我們選擇MOI=100為rAd5-CDKN1A shRNA轉染DPCs的理想滴度。既保證較高的轉染效率，又不至于因腺病毒本身對細胞毒性作用而干擾實驗結果。為將來研究p21對DPCs生物學特性的影響奠定了基礎。

1Matsuzaki T,Yoshizato K.Role of hair papilla cells on induction and regeneration processes of hair follicles〔J〕.Wound Repair Regen,1998;6(6):524-30.

2Yamao M,Inamatsu M,Ogawa Y,etal.Contact between dermal papilla cells and dermal sheath cells enhances the ability of DPCs to induce hair growth〔J〕.J Invest Dermatol,2010;130(12):2707-18.

3Gledhill K,Gardner A,Jahoda CA.Isolation and establishment of hair follicle dermal papilla cell cultures〔J〕.Methods Mol Biol,2013;989:285-92.

4徐 波，張松濤，李龍江,等.重組腺病毒p53轉染口腔黏膜異常增生的實驗研究〔J〕.華西口腔醫學雜志，2009;27(2)：122-5.

5Ohyama M,Zheng Y,Paus R,etal.The mesenchymal component of hair follicle neogenesis:background,methods and molecular characterization〔J〕.Exp Dermatol,2010;19(2):89-99.

6Millar SE.Molecular mechanisms regulating hair follicle development〔J〕.J Invest Dermatol,2002;118(2):216-25.

7Yamao M,Inamatsu M,Ogawa Y,etal.Contact between dermal papilla cells and dermal sheath cells enhances the ability of DPCs to induce hair growth〔J〕.J Invest Dermatol,2010;130(12):2707-18.

8Frey BM,Hackett NR,Bergelson JM,etal.High-efficiency gene transfer into ex vivo expanded human hematopoietic progenitors and precursor cells by adenovirus vectors〔J〕.J Blood,1998;91(8):2781-92.

9Lou J,Xu F,Merkel K,etal.Gene therapy:adenovirus-mediated human bone morphogenetic protein-2 gene transfer induces mesenchymal progenitor cell proliferation and differentiation in vivo and bone formation in vivo〔J〕.J Orthop Res,1999;17(1):43-50.

10Gartel AL,Radhakrishnan SK.Lost in transcription:p21 repression,mechanisms and consequences〔J〕.Cancer Res,2005;65(10):3980-5.