穗花杉雙黃酮對人胃癌細胞株MGC-803增殖抑制及凋亡的影響

徐洪霞 薛剛

【摘要】目的：研究穗花杉雙黃酮在體外對人胃癌細胞MCC-803增殖抑制及凋亡的影響。方法：應用MTT法檢測穗花杉雙黃酮對MGC-803細胞增殖的影響;應用流式細胞儀檢測穗花杉雙黃酮對MGC-803細胞凋亡的影響;應用Wes ternbolt檢測其對MCC-803細胞凋亡相關基因表達的影響。結果：穗花杉雙黃酮在對MGC-803細胞給藥24后，與空白組相比，能顯著MCC-803細胞的增殖，且這種抑制成濃度依賴關系。Annexin V/PI雙染法結果顯示穗花杉雙黃酮能誘導MCC-803細胞的凋亡，且呈現濃度依賴關系，Wes tern bolt結果顯示，穗花杉雙黃酮能上調Bax表達，下調Bcl-2表達。結論：穗花杉雙黃酮能有效抑制人胃癌細胞的增殖并誘導其凋亡;其機制可能是通過上調Bax表達，下調Bcl-2而實現。

【關鍵詞】穗花杉雙黃酮;MGC-803胃癌細胞;增殖;凋亡

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，其死亡率在所有惡性腫瘤位居前列[1]。手術治療是目前治療胃癌的主要手段之一，配合化療效果更佳，然而臨床上目前常用的化療藥物具有較強的毒副作用，大多數患者身體狀況已不能耐受化療，因而越來越多的研究者講研究重點放在從天然產物中尋找具有抑制腫瘤細胞的惡性增殖、誘導分化和促進凋亡的藥物中。

石上柏又名卷柏、深綠卷柏、大葉菜等，具有清熱解毒、抗癌止血的功效。主要成分為生物堿類、黃酮類、甾醇、皂苷、氨基酸等成分[2]。藥理活性研究發現其中一種黃酮類穗花杉雙黃酮在體外有細胞毒活性，文獻報道其有較強的抗腫瘤作用，為此，本文對穗花杉雙黃酮作用于人胃癌細胞及其機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料及試劑

穗花杉雙黃酮購買自中國藥品生物制品檢定所，用DMSO溶解，4℃保存，臨用前用完全培養基稀釋成所需濃度;1640培養基、小牛血清購買自美國Gibco公司;四甲基偶氮唑藍（MTT）試劑購自購買自Biosharp公司;Annexin-V/PI凋亡試劑盒購買自凱基公司，p-actin、Bax、Bcl-2 -抗購自美國santacruz公司，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗購買自北京中杉生物技術公司。

1.1.2 細胞株

人胃癌細胞株MGC-803細胞購自中研所，用含10%小牛血清以及1%雙抗的1640培養液，在5 %C02以及37℃環境下常規培養，取對數期生長期的細胞進行細胞實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測穗花杉雙黃酮對人胃癌細胞MGC-803增殖的影響

取對數期生長的細胞作為實驗細胞，接種于96孔板，實驗組加入含穗花杉雙黃酮（濃度依次為400μmol/L，200μmol/L，lOOμmol/L，50μmol/L）的1640培養液以及含DMSO的1640培養液（濃度為1%。），設空白對照組，繼續培養24h后，MTT法染色，計算抑制率（1一實驗組/對照組），實驗重復3次。

1.2.2 Annexin-V/PI雙染法聯合流式細胞儀檢測穗花杉雙黃酮對人胃癌細胞MGC-803的凋亡比率

將MGC-803細胞接種于直徑為6cm的培養皿，設2個給藥組以及1個5 -FU陽性對照組，濃度分別為400μmol/L，200μmol/L，50μg/ml，以及1個空白對照組，繼續培養24h后，Annexin-V以及PI雙染色，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.3 Westem Bolt實驗

將細胞消化下來后，收集各濃度組相關蛋白，以Bradford法測得各濃度組蛋白濃度，取20μg蛋白上樣量檢測。經SDSPAGE將蛋白分離后轉到PVDF膜上，隨后以5%脫脂奶粉溶液封閉PVDF膜th，一抗4℃過夜，次日二抗室溫孵育，PBST漂洗15min，使用ECL液進行發光和條帶分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS19.O統計軟件進行分析，數據以（x±s）表示，各組之間比較采用t檢驗，以*為P<0.05為差異有統計學意義。2結果

2.1 穗花杉雙黃酮對人胃癌細胞MGC-803的增殖抑制

在不同濃度的穗花杉雙黃酮作用于MGC-803細胞24h后，與對照組相比，400μmol/L、200μmol/L濃度組對MGC-803細胞抑制率分別達到87.74%±4.3%，56.74%±9.3%，呈現濃度時間依賴關系（圖1）。

2.2 穗花杉雙黃酮對人胃癌細胞MGC-803凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，穗花杉雙黃酮在作用于人胃癌細胞MGC-803 24h后，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡結果示：隨著給藥濃度的增加，MGC-803細胞早期凋亡率從5.95%增加到19.18%、80.13%，5-FU陽參組早期凋亡為10.25% （P<0.05），與對照組相比具有統計學意義，并且隨著給藥濃度的增加各濃度組早期凋亡率呈上升趨勢，呈濃度依賴關系（圖2）。

2.3 穗花杉雙黃酮對MGC-803細胞凋亡相關基因表達的影響

Annexin-V/PI雙染法顯示穗花杉雙黃酮能誘導人胃癌細胞凋亡，繼而我們運用Westem Blot實驗進一步探討其誘導MGC-803細胞凋亡的分子機制。如圖所示（圖3），穗花杉雙黃酮作用于MGC-803細胞24h后，與對照組相比，給藥組Bax基因條帶隨著給藥濃度的上升其表達量明顯增高，Bcl-2基因條帶隨著給藥濃度的增加表達量減小，為此我們可得出結論，穗花杉雙黃酮其能上調人胃癌癌細胞MGC-803 Bax蛋白表達下調Bcl-2蛋白表達引起細胞凋亡。

3 討論

腫瘤細胞的無限增殖生長是惡性腫瘤的特征之一。研究表明，細胞凋亡在惡性腫瘤的發病機制中起著非常重要的作用[3]。細胞凋亡不是一個被動的過程，而是一個主動過程，它涉及到很多方面如基因的激活、表達以及調控等。Bcl-2家族蛋白是重要的細胞凋亡調節因子[4]。因此，研究Bcl-2家族對于探索新的腫瘤治療方法具有重要價值。

通過本實驗，我們得出以下結論：（1）穗花杉雙黃酮能和抑制人胃癌細胞MGC-803的增殖，且這種抑制呈現出時間濃度依賴關系; （2）穗花杉雙黃酮能夠誘導細胞細胞凋亡; （3）其誘導細胞凋亡機制為上調Bax的表達，下調Bcl-2蛋白表達。

參考文獻

[1]W Chen， RSZheng， et al. CancerStatistics in China， 2015 [J]. CACANCER J CLIN 2016， 66：115-132.

[2]孫麗娜.卷柏的化學成分及其藥理作用概述[J].遼寧中醫藥大學學報，2008，12： 193-184.

[3]馮群，夏嬙.基于細胞凋亡信號通路的抗菌肽抗腫瘤機制的研究進展[J].廣東醫學，2018，39 （03）：466-469.

[4]寇玉輝，張英俊，謝洪明，林興龍，許娟.Bcl-2蛋白及其相關藥物的研究進展[J].系統醫學，2018，3（13）：193—195.