Slit2/Robo1信號通路與腫瘤相關(guān)性的研究進展

沈益飛, 張云坤

(南京醫(yī)科大學附屬常州市第二人民醫(yī)院 骨科, 江蘇 常州, 213003)

1988年 Rothberg等[1]發(fā)現(xiàn)果蠅的中樞神經(jīng)中線膠質(zhì)細胞可合成Slit蛋白，其缺乏可導致縱行傳導通路和交叉(聯(lián)合)神經(jīng)元軸突在中線發(fā)生聚集異常。1998年, Kidd等[2]首次提出Roundabout(Robo)蛋白是Slit的受體，為進一步研究Slit蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。Slit-Robo通路包括Slit分泌蛋白家族(Slit1、2、3)及其特異性受體(Robo1、2、3、4), 其中Slit2/Robo1信號通路最初發(fā)現(xiàn)是與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)[3-5], 深入研究[6-8]發(fā)現(xiàn)Slit2與Robo1相互作用還可以調(diào)節(jié)白細胞趨化性、中胚層的遷移以及血管平滑肌細胞的遷移。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn), Slit2和Robo1的相互作用可以誘導腫瘤的發(fā)生。研究[9-10]表明, Slit2和Robo1的啟動子在幾種不同類型的癌癥中是高甲基化的, Slit2/Robo1參與多種不同的腫瘤細胞活動過程，比如增殖和遷移。本研究對Slit2/Robo1在不同腫瘤中的作用綜述如下。

1 Robo1、Slit2基因及結(jié)構(gòu)特征

人類Robo1基因位于人染色體的3p12.3, 其編碼跨膜蛋白受體。Robo1蛋白包含5個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域, 3個纖連蛋白III結(jié)構(gòu)域, 1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)片段。其細胞內(nèi)區(qū)包含4個特定的保守基序，即CC0、CC1、CC2和CC3。Robo1胞外的IgG結(jié)構(gòu)域被認為是與配體Slit2結(jié)合所必需的，胞內(nèi)區(qū)域則和一些重要的信號分子相互作用，參與Slit/Robo下游的信號轉(zhuǎn)導，從而完成刺激信號由細胞外部至內(nèi)部骨架的傳遞[11]。

Slit2基因定位于人染色體4p15.2, 編碼人類與果蠅 Slit2 同源的細胞外基質(zhì)分泌性糖蛋白，是 Slit 基因家族(Slit1～3)的一員，其主要功能是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中調(diào)節(jié)軸突導向和神經(jīng)細胞的遷移[12]。Slit2蛋白的結(jié)構(gòu)包括1個信號肽、4個獨特的富含亮氨酸重復單位(LLR)D1-D4, 其后連接9個類似表皮生長因子(EGF)重復區(qū)(果蠅為7個), 1個群集層黏連蛋白-基底膜蛋白多糖-Slit的保守隔離模體, 1個富含半胱氨酸區(qū)。LLR區(qū)為與Robo1相互作用及軸突導向作用所必需, EGF重復區(qū)和Slit的彌散有關(guān)，模體具有調(diào)節(jié)蛋白-蛋白、基質(zhì)-蛋白的相互作用的功能[13-14]。

2 Slit2/Robo1與腦膠質(zhì)瘤

鑒于Slit2/Robo1信號通路在神經(jīng)發(fā)育過程中起著重要作用，研究人員最早將目光投向了其在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的作用。腦膠質(zhì)瘤組織中的Slit2基因啟動子出現(xiàn)異常甲基化，是導致Slit2的表達下調(diào)的主要原因[15]。Li等[16]通過表達譜分析對比正常腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中Slit2和Robo1的表達量，發(fā)現(xiàn)Slit2在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達量明顯低于正常組織，且隨著腫瘤分級的升高而逐漸降低，而Robo1的在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達明顯高于正常組織，預后生存分析Slit2、Robo1均陽性表達的患者生存率明顯優(yōu)于Slit2陰性表達、Robo1陽性表達患者。在腦膠質(zhì)瘤中, Slit2的表達與Robo1的表達具有顯著負相關(guān)性, Slit2的低表達和Robo1的高表達可能與膠質(zhì)瘤的侵襲性、惡性進展以及不良預后有著密切的關(guān)系，且Slit2的表達缺失和Robo1表達增高可能具有協(xié)同作用，二者的差異表達共同促進了膠質(zhì)瘤的生成，在膠質(zhì)瘤的發(fā)病以及進展中發(fā)揮著重要作用。

Slit2/Robo1影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的機制目前并未明確。Jean J等[17]發(fā)現(xiàn)在多種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中, Slit2的表達量較正常人星形膠質(zhì)細胞均有明顯下調(diào)，通過體內(nèi)外實驗證明Slit2通過其受體Robo1抑制膠質(zhì)瘤細胞中Cdc42的活性，從而通過抑制Cdc42-GTP活性來特異性地抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲。最新研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(micro-RNA)可以通過Slit2/Robo1信號通路調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。JIAN等[18]發(fā)現(xiàn), microRNA218(mi-218)的過表達可以促進膠質(zhì)瘤細胞中Slit2的表達，同時降低Robo1的表達，從而抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲力。

3 Slit2/Robo1與消化系統(tǒng)腫瘤

3.1 Slit2/Robo1與食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌

Ruo-Chia等[19]通過免疫組織化學、甲基化測序等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織中Slit2啟動子高甲基化，導致Slit2蛋白表達降低。體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，敲除Slit2可增強ESCC細胞遷移，而Slit2穩(wěn)定的過表達則減弱了ESCC細胞遷移。Slit2/Robo1在胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Kim等[20]對11個胃癌細胞系、96對胃癌組織和相鄰正常胃組織中的Slit2表達和甲基化情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)Slit2 在早期胃癌和晚期胃癌中均發(fā)現(xiàn)甲基化。Shi等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細胞中干擾Slit2表達會增加AKT磷酸化，從而活化抗凋亡信號，抑制GSK3β活性并誘導β-catenin活化入核，最后激活AKT/β-連環(huán)蛋白介導的腫瘤生長信號通路，促進胃癌生長和轉(zhuǎn)移。Huang等[22]比較結(jié)直腸癌組織與癌旁組織發(fā)現(xiàn)，CRC組織中Slit2基因的啟動子廣泛超甲基化從而導致Slit2表達減少，進一步研究機制發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細胞系LoVo、HCT116細胞中的泛素特異性蛋白酶33(USP33)與Robo1相互作用，增強細胞內(nèi)Slit2表達，進而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移 。Feng Y等[23]通過免疫沉淀(IP)、免疫熒光(IFCRC)等研究方法發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細胞中srGAP1是Robo1的相互作用蛋白, srGAP1是CRC中Slit2信號的重要下游分子，通過抑制Cdc42介導Slit2的抗遷移功能。但是，也有學者認為, Slit2/Robo1促進腸道腫瘤發(fā)生發(fā)展。Qian等[24]研究發(fā)現(xiàn), Slit2/Robo1結(jié)合可以通過激活Src磷酸化，進而激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(β-catenin)通路誘導上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變(EMT)繼而促進腸道腫瘤發(fā)生。最新的研究[25]顯示, Slit2還可能是遺傳性結(jié)直腸癌(CRC)遺傳易感性的潛在作用基因。

在消化系統(tǒng)腫瘤中，也已發(fā)現(xiàn)多種微小RNA(micro-RNA)通過Slit2/Robo1信號通路調(diào)控腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展。miR-1179在ESCC細胞中表達上調(diào)，通過抑制Slit2/Robo1通路增強ESCC細胞的侵襲能力[26]; 在胃癌細胞中, miR-218的表達與Slit2的甲基化呈負相關(guān), miR-218通過作用于Robo1干擾Slit2/Robo1通路，從而破壞胃癌血管的行成，抑制腫瘤細胞生長[27]。

3.2 Slit2/Robo1與胰腺癌、肝癌

Katia等[10]從表觀遺傳學的角度研究了Slit2/Robo1在腺癌中的變化，在對167例胰腺導管腺癌組織行大規(guī)模的甲基化和表達譜分析后發(fā)現(xiàn), Slit2與Robo1的CpG島和啟動子區(qū)域均出現(xiàn)超甲基化現(xiàn)象，從而導致Slit2-Robo1信號通路的表觀遺傳失活。JIANG等[28]建立了胰腺癌細胞系和高淋巴轉(zhuǎn)移潛能的小鼠模型，并觀察到胰腺癌細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移型小鼠中Robo1較未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的小鼠表達下調(diào)。值得注意的是, Secq等[29]研究了腫瘤內(nèi)微環(huán)境(基質(zhì))對PDAC進展的影響，發(fā)現(xiàn)癌相關(guān)成纖維細胞(CAF)分泌Slit2通過調(diào)節(jié)N-鈣黏蛋白/β-catenin信號傳導，促進背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元以及施旺(Schwann) 細胞遷移與增殖，從而增加神經(jīng)突的生長，抑制Slit2/Robo1信號傳導則可破壞這種基質(zhì)、神經(jīng)連接，減少患者術(shù)后復發(fā)率和腫瘤后期疼痛感。Jin[30]等首先報道了肝癌細胞中(HCC)中存在Slit2的表觀遺傳學沉默，他們通過對54例原發(fā)性肝癌組織進行甲基化分析發(fā)現(xiàn)，由于Slit2的CpG島高甲基化，使其表達較正常肝細胞下調(diào)。Mano等[31]通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，抑制Slit2/Robo1表達可以促進肝癌細胞增殖和遷移，而過度表達Robo1與Slit2則可以顯著抑制癌細胞增殖和遷移。Slit2/Robo1為肝癌的治療提供一個新的可能治療靶點。

4 Slit2/Robo1與婦科腫瘤

4.1 Slit2/Robo1與卵巢癌

RDONG等[32]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織和卵巢癌患者血清樣品中Slit2基因啟動子出現(xiàn)異常甲基化狀態(tài)，其中包括早期卵巢癌患者的血清樣品。Hai等[33]也發(fā)現(xiàn)了上述現(xiàn)象，在將Slit2去甲基化恢復表達后，可以明顯抑制卵巢癌細胞生長、遷移、集落形成能力并誘導腫瘤細胞凋亡。 這些結(jié)果表明Slit2是卵巢癌的腫瘤抑制因子，將來可能是卵巢癌治療的新靶點。

4.2 Slit2/Robo1與子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌

子宮內(nèi)膜癌(EC)是常見的女性惡性疾病，約占女性腫瘤的7%, 是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占生殖道惡性腫瘤的20%～30%[34]。目前的研究主要認為, Slit2/Robo1信號通路通過調(diào)控內(nèi)膜癌組織中的微血管密度而影響子宮內(nèi)膜癌的預后及復發(fā)。Shulan等[35]對比了45例子宮內(nèi)膜癌復發(fā)患者與110例未復發(fā)患者的Slit2與Robo1的表達情況，發(fā)現(xiàn)Slit2和Robo1在復發(fā)組內(nèi)膜癌中表達明顯高于未復發(fā)組，且Slit2和Robo1 表達均與微血管密度(MVD)呈正相關(guān)。有趣的是，目前有學者[36]發(fā)現(xiàn)，一定濃度雌激素可以刺激子宮內(nèi)膜癌細胞中的Slit2 mRNA的表達，而孕激素則會拮抗上述作用。Ratnesh KS等[37]通過微衛(wèi)星分析發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌組織樣本中Slit2啟動子超甲基化及Slit2缺失現(xiàn)象，經(jīng)多因素分析顯示Slit2缺失與其啟動子甲基化存在顯著相關(guān)性，可能在宮頸癌發(fā)展中起重要作用。Sraboni M等[38]通過對宮頸癌組織樣本和宮頸癌細胞系進行表達譜分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性宮頸癌中Slit2和Robo1的RNA和蛋白質(zhì)表達均降低，認為Slit2/Robo1的表達水平與腫瘤的分期和預后有關(guān), Slit2/Robo1表達越低則預示著腫瘤分期越高、預后越差。

5 Slit2/Robo1與其他腫瘤

5.1 Slit2/Robo1與乳腺癌

Slit2/Robo1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及腦轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Dallol等[39]發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者組織中的Slit2基因啟動子出現(xiàn)異常甲基化，從而下調(diào)了Slit2的表達。Feng等[40]通過評估118例浸潤性導管癌(IDC), 44例導管原位癌(DCIS)和34例良性乳腺病變的Slit2和Robo1的免疫組織化學染色、mRNA表達水平發(fā)現(xiàn), Slit2和Robo1低表達的浸潤性導管癌患者預后較差，且較大概率出現(xiàn)腦特異性轉(zhuǎn)移。Chang等[41]對乳腺癌細胞微環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞的致癌潛力是由其Robo1受體及其間質(zhì)成纖維細胞分泌的配體Slit2之間的相互作用決定的。活性Slit2/Robo1信號的存在能阻止β-catenin轉(zhuǎn)移到細胞核中，繼而通過磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途徑下調(diào)c-myc和細胞周期蛋白D1的表達。結(jié)合臨床，乳腺癌細胞中的Robo1表達與乳腺癌患者生存期呈正相關(guān)，基質(zhì)成纖維細胞中Slit2的低表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。根據(jù)目前研究提示Slit2/Robo1可能在抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展及腦轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。可能成為判斷乳腺癌預后和腦轉(zhuǎn)移的分子標志物，為乳腺癌的治療提供新靶點。

5.2 Slit2/Robo1與肺癌

Slit2/Robo1在肺癌中的作用較為復雜。Yong-Jae等[42]對人肺鱗狀細胞癌(SCC)組織與正常肺組織進行焦磷酸測序法分析發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中Slit2啟動子區(qū)域的出現(xiàn)高甲基化現(xiàn)象。Suzuki等[43]在非小細胞肺癌組織中也檢測到類似現(xiàn)象。Li等[44]對非小細胞肺癌癌旁組織、肺癌組織、腦轉(zhuǎn)移組織進行Robo1表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)Robo1的陽性表達率依次增高，且 Robo1在肺癌腦轉(zhuǎn)移中的表達與肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的預后呈負相關(guān)。Wen等[45]進一步發(fā)現(xiàn)了泛素特異性蛋白酶33(USP33)可以調(diào)節(jié)肺癌細胞的Slit-Robo信號傳導，在正常肺細胞中, Slit2結(jié)合Robo1并激活下游分子，調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架并抑制細胞遷移。 去泛素化酶USP33可減少Robo1的泛素化和降解，從而穩(wěn)定Robo1蛋白。 然而，在肺癌細胞中，表達下調(diào)的USP33導致Robo1的泛素化和降解增加，從而干擾了Slit2/Robo1信號通路，進而促進肺癌細胞遷移。

6 小 結(jié)

Slit2/Robo1在不同腫瘤中機制不同，作用也不盡相同。Slit2/Robo1除了通過抑制或促進Wnt/β-catenin等經(jīng)典的原癌通路來促進或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也可以通過影響腫瘤血管密度、腫瘤微環(huán)境來影響腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移。值得注意的是，在結(jié)直腸癌中，不同的學者發(fā)現(xiàn)了Slit2/Robo1兩種相反的作用，這可能與Robo1的突變有關(guān)。Feng等[46]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，在白血病細胞中過表達Robo1可以產(chǎn)生抗增殖和促凋亡作用，然而，這種作用在Robo1突變體中喪失。Robo1在結(jié)直腸癌或其他腫瘤中是否存在突變并引起相反的兩種作用值得進一步研究。近年來，隨著對microRNA的認識及研究深入，目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA通過作用于Slit2或Robo1從而影響腫瘤的進展。其中miR-218在膠質(zhì)瘤、胃癌等多種腫瘤中均可以作用于Slit2/Robo1起到抑癌作用，這也為腫瘤的靶向治療提供新的思路。因此, Slit2/Robo1信號通路有可能成為多種腫瘤預防和治療的潛在靶標。