miRNA-126抑制乳腺癌轉移的作用靶點研究進展

馮雪松，高琦，魯明騫，陸海燕，蘇進

(三峽大學第一臨床醫學院 宜昌市中心人民醫院，湖北宜昌443000)

乳腺癌是世界范圍內女性癌癥相關死亡的主要原因，以侵襲性局部浸潤、早期轉移和多藥耐藥為特征。目前放化療是非手術治療乳腺最主要的方法，但會抑制免疫系統，長期應用可產生抵抗而降低療效。因此，尋找有效的、特異的腫瘤標志物進行精準靶向治療是目前研究的熱點。miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的非編碼RNA，可通過直接剪切靶基因或與靶基因的3′末端互補結合抑制靶基因的轉錄來調節基因表達，在腫瘤的發生發展中起到癌基因或抑癌基因的作用。我們的前期研究發現，miR-126作為乳腺癌的一種抑癌基因，位于人類染色體9q34.3的類表皮生長因子7(Egfl-7)宿主基因上，對乳腺癌的生長及轉移起抑制作用。本文對miRNA-126抑制乳腺癌轉移的作用靶點綜述如下。

1 血管內皮生長因子(VEGF)

VEGF是一種重要的生長因子，可以調節血管生成[1]，并激活PI3K/AKT信號通路，促進血管內皮細胞的生長、遷移和一氧化氮的產生[2]，是涉及腫瘤血管發生的主要細胞因子之一，可通過促進腫瘤血管生成，增強乳腺癌細胞的增殖、轉移和復發。

Zhu等[3]研究發現，miR-126及其宿主基因Egfl-7在大鼠組織中廣泛表達，但在內皮細胞中表達減少。通過熒光素酶報告基因檢測和Western blotting檢測發現，VEGFA可作為miR-126的作用靶點。在VEGF/PI3K/AKT信號通路被激活的乳腺腫瘤組織中，miR-126的表達下調；而將miR-126模擬物引入乳腺癌MCF-7細胞中，可有效降低VEGF/PI3K/AKT信號傳導活性。這些結果表明，內皮特異性miR-126可靶向VEGFA，通過調節VEGF/PI3K/AKT信號通路在腫瘤發生和轉移中起作用。另外，一些研究也得到了相同的結論。例如：米旭光等[4]研究發現，miR-126 在乳腺癌組織中低表達，與VEGF表達呈負相關；上調miR-126可以降低VEGF表達，抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力。Yoshida等[5]發現，miR-126敲除的癌細胞中VEGF誘導的ERK和AKT磷酸化增加，提示miR-126可通過靶向VEGF調節VEGF/PI3K/AKT信號通路起到腫瘤抑制作用。

2 磷脂酰肌醇3-激酶調節亞基β(PIK3R2)

PIK3R2是位于AKT上游的PI3K的調節成分，可結合并滅活PI3K，而PI3K的失活對PI3K/p-AKT通路功能有重要影響[3]。PI3K/p-AKT信號通路負責調節癌癥發展過程中的細胞生長、增殖、存活和血管生成，故改變PIK3R2的表達可能是降低癌癥轉移的有效途徑。既往已有研究表明，miR-126可通過直接靶向PIK3R2的3′非編碼區域來降低PIK3R2的表達[6,7]，因此，miR-126可直接靶向PIK3R2，通過參與PI3K/p-AKT信號通路抑制血管生成以降低乳腺癌的增殖、轉移。并且，Zhu等[3]通過熒光素酶報告基因檢測和Western blotting檢測發現，VEGFA可作為miR-126的作用靶點的同時也可直接靶向PIK3R2。

為研究miRNA-126在不同的類型乳腺癌細胞系的作用，Turgut等[8]通過轉染miR-126模擬物及抑制劑的方法，發現miR-126在細胞行為上對高轉移性的MDA-MB-231細胞更有效，并發現miR-126調節了MCF-7和MDA-MB-231細胞中VEGF/PI3K/AKT和MAPK信號傳導的基因表達。因此，他們認為miR-126對轉移性乳腺癌的抑制更有效，進一步證明了miR-126抑制乳腺癌轉移的作用。

3 Egfl-7

在脊椎動物中，Egfl-7基因能夠編碼生物活性miRNA[9]。miR-126是其中的一種，在人類染色體9p34.3區的內含子7中發現，具有內皮細胞特異性，控制著從造血譜系中分化出的多種細胞功能，包括巨核細胞和紅細胞[10]。Zhang等[11]研究表明，宿主基因Egfl-7的表觀遺傳調控與乳腺癌進展期間miR-126表達的改變密切相關。

Turgut等[8]報告了Egfl -7是miR-126的靶標之一，miR-126位于Egfl-7的3′-非編碼區中。在乳腺癌MCF-7細胞實驗中，雖然在用miR-126抑制劑轉染的MCF-7細胞中，Egfl-7基因表達沒有觀察到統計學上顯著增加；但當miR-126模擬物轉染到MCF-7細胞時，Egfl-7基因表達在統計學上顯著降低。在乳腺癌MDA-MB-231細胞中實驗中，在用miR-126模擬物轉染的MDA-MB-231細胞中，觀察到Egfl-7基因表達的統計學顯著降低；在用miR-126抑制劑轉染的MDA-MB-231細胞中，測定到Egfl-7基因表達的統計學顯著增加。這表明miR-126對高轉移性MDA-MB-231細胞的抑制作用更顯著，說明miR-126可通過靶向Egfl-7對乳腺癌的轉移起抑制作用。

4 基質細胞衍生因子1α(Sdf-1α)

腫瘤轉移是一個復雜的過程，涉及癌細胞與細胞外基質的相互作用。腫瘤基質是癌癥進展期間的積極參與者，腫瘤基質微環境被認為對于通過促進腫瘤相關的脈管系統形成或通過交換癌細胞背景信號來獲取和維持癌細胞的轉移能力至關重要。研究表明，miRNA可以通過改變癌細胞自主特征來調節轉移過程的多個方面。Zhang等[11]研究發現，來自單一前體的miR-126和miR-126*均可抑制間充質干細胞和炎性單核細胞向腫瘤基質中募集，以抑制小鼠異種移植瘤模型中乳腺癌細胞的肺轉移。

Sdf-1α是由乳腺癌細胞和相關基質細胞如成纖維細胞分泌的多功能趨化因子，可以通過Sdf-1/CXCR4/ERK信號通路促進腫瘤細胞增殖和遷移[12]，并從骨髓中募集內皮足細胞(EPCs)、造血干細胞(HSCs)和間充質肝細胞(MSCs)進入腫瘤微環境。Sdf-1α/CXCL-12是miR-126的直接靶標。Zhang等[11]發現，miR-126可直接抑制Sdf-1α表達，并間接抑制Sdf-1依賴的癌細胞中趨化因子配體2(CCL-2)的表達，進而抑制乳腺癌的轉移；同時發現，miR-126下調與乳腺癌患者較差的無轉移生存率存在相關性。

5 解整合素金屬蛋白酶(ADAM)

ADAM是具有許多特征結構域的模塊化Ⅰ型跨膜蛋白，包括金屬蛋白酶、解整合素和跨膜結構域[13]。研究發現，與相鄰正常組織比較，乳腺癌組織中miR-126的表達明顯下調；并且，miR-126表達上調可顯著降低ADAM9蛋白水平，進而抑制體外乳腺癌細胞侵襲；通過小干擾RNA敲低ADAM9，也抑制乳腺癌細胞侵襲。這些表明，miR-126的表達增加可通過下調ADAM9直接抑制細胞侵襲，達到抑制乳腺癌轉移的作用。另外，Kelwick等[14]研究也發現，ADAM增加與癌癥進展密切相關；并且，ADAM9在各種類型癌癥中上調，包括乳腺癌[15]。還有一些報道發現，ADAM9涉及乳腺癌細胞侵襲的負調控[16,17]。這些結果均表明，miR-126可靶向ADAM對乳腺癌轉移起抑制作用。

6 1型芽生性相關絡氨酸激酶結構域(SPRED-1)

SPRED-1是Ras-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和RhoA細胞信號通路的抑制劑，在腫瘤發生和轉移中起重要作用[18]。其活性主要受到酪氨酸磷酸化的調節，由造血因子促進，可結合并滅活參與MAPK信號傳導通路并且代表信號通路的上游激酶RAF-1。而miR-126表達下調與 SPRED-1表達增加相關，導致RAF(p-RAF/RAF)和MAPK(p-MAPK/MAPK)活化降低，從而抑制VEGF途徑，進而抑制腫瘤增殖、轉移[19]。并且，Turgut等[8]在研究miR-126在不同的類型乳腺癌細胞系的作用時，發現miR-126也可調節MCF-7和MDA-MB-231中MAPK信號傳導的基因表達。另外在幾項研究中，也報道過SPRED-1和PIK3R2水平的降低與miR-126的表達增加密切相關，miR-126可通過靶向SPRED-1和PIK3R2調節MAPK和VEGF/PI3K/AKT信號傳導中的VEGF信號轉導[9]。

7 CD97

CD97是一種刺激腫瘤細胞侵襲和通過募集內皮細胞誘導血管發生來促進轉移的轉移性G蛋白偶聯受體(GPCR)。Lu等[20]為了闡明miR-126抑制腫瘤的機制，使用BOBCAT和SILAC兩種互補的蛋白質組學方法，分析了人類轉移性乳腺癌細胞MDA-MB-231中miR-126過表達的蛋白質組學，發現了一種新的miR-126直接作用靶標CD97。miR-126表達下調與癌癥中CD97的過度表達有關，表明miR-126可直接靶向CD97在細胞自主和非細胞自主性癌癥進展中起腫瘤抑制作用。

8 胰島素受體底物1(IRS-1)

為了鑒定miR-126的靶基因，Zhang等[21]使用開放獲取軟件對在3′-非編碼區中具有miR-126互補位點的基因進行計算篩選，選擇具有高預測分數并與細胞生長相關的4個基因(IRS1、TOM1、RGS3、CCNE2)，于進一步分析發現miR-126顯著抑制了IRS-1 3′-非編碼區的熒光素酶活性，表明miR-126可以靶向IRS-1。通過轉染miR-126模擬物，IRS1蛋白水平呈劑量依賴性下降；并且IRS-1的敲除導致細胞生長減少，其重現了miR-126的細胞抑制作用。因此，他們認為miR-126作為細胞生長抑制因子，可靶向IRS-1并抑制G1/G0到S期的細胞周期轉換達到抑制腫瘤的作用。另一項研究發現，miR-126影響IRS-1表達，并導致乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞的生長下降[22]。Lu等[20]研究發現，miR-126可以通過靶向IRS-1來抑制細胞自主的癌癥進展，以抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲。

9 其他

一些誘導表達及敲除表達實驗表明，miR-126通過靶向協調促凋亡基因胰島素樣生長因子結合蛋白2(IGFBP2)、磷脂酰肌醇轉移蛋白(PITPNC1)和c-Mer酪氨酸激酶(MERTK)抑制轉移性內皮募集、血管生成，從而抑制免疫缺陷型SCID小鼠中的人乳腺癌MDA-MB-231細胞的肺轉移定植[23,24]。Lu等[20]也發現，miR-126可通過下調IGFBP2、MERTK和PITPNC1以非細胞自主的方式限制細胞募集以抑制轉移。

目前，國內外對miR-126在乳腺癌中作為抑癌基因發揮抑制作用，尤其是乳腺癌轉移的抑制作用方面的研究較多，并且研究者們正在積極尋找miR-126可能的作用靶點，目的是為了尋找到其特異性的作用靶標并研發相關的藥物進行精準靶向治療。目前，被報道得最多的與miR-126對乳腺癌轉移抑制作用相關的靶點是VEGF和PIK3R2，通過調節VEGF/PI3K/AKT信號通路，抑制血管內皮細胞的募集及新生血管形成起到抑制乳腺癌增殖、轉移的作用。一些其他的可能靶點如Egfl-7、Sdf-1α、ADAM、SPRED-1、CD97、IRS-1、IGFBP2、PITPNC1和MERTK，可能在miR-126對乳腺癌轉移的抑制作用方面發揮著或多或少的作用。本文旨在將目前研究出的可能靶點進行綜述，為后來的研究提供可供參考的依據，并為基于miR-126進行靶向治療新藥的開發提供可供參考的靶點及科學依據。