miR-142在乳腺癌組織和細胞中的表達變化及其對MDA-MB-231細胞侵襲遷移能力的影響

胡潺潺，李青山，劉蘭芳，梁云微，朱翠敏，張晶晶，李愛科，王銳

(承德醫學院附屬醫院，河北承德067000)

乳腺癌是全球最常見的女性惡性腫瘤之一[1]，腫瘤的侵襲轉移是其死亡的主要原因之一。雖然，近十幾年來的手術技術及藥物治療取得明顯進步，但患者5年總生存率并未得到明顯提高[2]。近期研究發現，微小RNA(miRNA)在眾多惡性腫瘤的侵襲轉移中發揮重要作用[3]。miR-142是miRNA家族成員之一[4]，在多種惡性腫瘤中表達異常，推測其在惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用[5]。但是，目前有關miR-142在乳腺癌中表達情況的研究甚少，并且作用機制尚不清楚。2017年12月～2018年4月，我們觀察了乳腺癌組織和細胞中miR-142的表達變化，并通過脂質體轉染技術上調乳腺癌細胞MDA-MB-231中miR-142的表達，探討miR-142對乳腺癌細胞侵襲和遷移的影響，為乳腺癌的靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 組織細胞樣本 收集2016年5月～2017年5月在承德醫學院附屬醫院手術切除的92例女性乳腺癌患者的乳腺癌組織及相對應的癌旁組織(距腫瘤邊緣5 cm以上)，組織離體后立即置于液氮中，-80 ℃冰箱保存?；颊咝g前未行放化療及其他抗腫瘤治療，術后均經病理檢查確診。本研究獲醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468及人正常乳腺上皮細胞HBL-100均購自美國典藏細胞庫(ATCC)，其中MDA-MB-231和MDA-MB-468為高侵襲性乳腺癌細胞，MCF-7為低侵襲性乳腺癌細胞[6]。

1.1.2 主要試劑 RPMI1460培養基及DMEM培養基購自美國Gibco公司；miR-142模擬物及陰性對照序列購自上海吉瑪制藥公司，miR-142及內參U6 snRNA引物均購自廣東銳博生物公司，TRIzol試劑及LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑均購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與轉染處理 將各類乳腺癌細胞均接種于含10%胎牛血清的RPMI1460培養基，人正常乳腺上皮細胞接種于DMEM培養基中，均置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。取對數生長期的MDA-MB-231細胞并分為觀察組和對照組，消化、離心后接種于6孔板(2×105/孔)；細胞融合達70%～80%時更換培養液，觀察組和對照組采用LipofectamineTM2000脂質體試劑盒轉染miR-142模擬物及陰性對照序列，轉染后24 h進行后續實驗。

1.2.2 組織和細胞中miR-142檢測 采用qRT-PCR法。采用TRIzol試劑提取各類組織及細胞總RNA，用超微量分光光度儀測定RNA的濃度及純度。以100 ng總RNA為模板，按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄得到cDNA。取cDNA和引物，根據qRT-PCR試劑盒說明書配制PCR體系進行反應。反應條件：95 ℃ 變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環。miR-142引物序列上游為5′-TGCAGGGCAGCAGAGGAGCTGCTGT-3′,下游為5′-ACTGAGGCTCTGGGCAGTCAGGACC-3′。以U6作為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-142相對表達水平。

1.2.3 轉染后MDA-MB-231細胞侵襲及遷移能力觀察 采用Transwell侵襲及遷移實驗。Transwell小室內膜均勻涂抹Matrigel膠，放置過夜成膜。用無血清DMEM培養基重懸細胞，制作細胞密度為1×105/mL的細胞懸液。細胞饑餓處理后，按200 μL/孔將細胞懸液加入小室上室，在小室下室加入500 μL含10% 胎牛血清的DMEM培養基,置于37 ℃孵育培養24 h。取出小室，PBS沖洗后用棉簽擦除上室內膜黏附的細胞；甲醛固定,PBS沖洗后染色；倒置顯微鏡下隨機取5個高倍視野，計數穿透濾膜的細胞，以此表示細胞的侵襲能力。遷移實驗除了小室內膜上不給予涂抹Matrigel膠外，余操作同侵襲實驗，以穿透濾膜的細胞數表示細胞的遷移能力。

2 結果

2.1 乳腺癌、癌旁組織中miR-142表達比較 乳腺癌組織中miR-142相對表達量為0.35±0.09，低于癌旁組織中的1.02±0.04(P<0.01)。

2.2 乳腺癌和正常乳腺上皮細胞中miR-142表達比較 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468細胞中miR-142相對表達量分別為0.53±0.05、0.17±0.06、0.19±0.08，均低于人正常乳腺上皮細胞HBL-100中的1.01±0.03(P均<0.01)，且高侵襲性乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-468中miR-142相對表達量低于低侵襲性乳腺癌細胞MCF-7(P均<0.01)。

2.3 兩組轉染后的MDA-MB-231細胞中miR-142表達比較 轉染后觀察組MDA-MB-231細胞中miR-142相對表達量為32.97±1.89，高于對照組的1.01±0.06(P<0.01)。

2.4 各組轉染后的MDA-MB-231細胞侵襲和遷移能力比較 觀察組遷移和侵襲實驗中穿膜細胞分別為(110±15)、(52±9)個，均低于對照組的(305±27)、(148±16)個(P均<0.01)。

3 討論

miRNA是一類存在于真核細胞內的小分子非編碼單鏈短RNA，長度為18～23個核苷酸。miRNA通過其種子序列完全或部分與靶基因mRNA的3′非翻譯區互補配對，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而調控靶基因的表達，在細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等機體生理或病理過程中發揮極其重要的作用[7，8]。適當的miRNA表達水平是維持細胞穩態及機體正常功能的必要條件，異常的miRNA表達在惡性腫瘤中的發生發展中發揮著重要作用，起著類似癌基因或者抑癌基因的作用[9,10]。

miR-142是miRNA家族重要成員之一，2004年由Chen等[11]首先在造血干細胞中發現并報道。研究表明，miR-142在維持干細胞分化及細胞的增殖、凋亡等方面發揮著重要作用[12]。近期研究結果表明，miR-142在惡性腫瘤的發生發展中也起重要作用，但有關miR-142在惡性腫瘤中表達情況的研究結果不同。研究結果表明，miR-142在肝細胞癌[13]、非小細胞肺癌[14]、宮頸癌[15]、急性淋巴細胞白血病[16]、骨肉瘤[17]等惡性腫瘤中表達水平降低，起著抑癌基因的作用；但在鼻咽癌[18]、結腸癌[19]、腎細胞癌[20]等惡性腫瘤中表達升高，起著癌基因的作用。這說明miR-142在惡性腫瘤中的作用機制復雜，通過多種不同的分子通路參與腫瘤的發生發展。目前，有關miR-142在乳腺癌中的研究甚少。本研究結果顯示，乳腺癌組織中miR-142表達低于癌旁組織，并且乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468中miR-142表達均低于正常乳腺上皮細胞HBL-100。這說明miR-142異常表達與乳腺癌的發生有關，可能在乳腺癌的發生中起著抑癌基因的作用。

乳腺癌的局部浸潤和遠處轉移是目前治療的難點，是乳腺癌患者死亡的最主要原因之一。miRNA在腫瘤中的功能研究，為惡性腫瘤的進展及侵襲轉移機制提供了新思路。研究報道，在高侵襲性的乳腺癌細胞中miR-21高表達、miR-149低表達，可作為乳腺癌高侵襲性的分子標志[21,6]。本研究發現，高侵襲轉移乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-468中miR-142表達低于低侵襲轉移乳腺癌細胞MCF-7，提示miR-142異常低表達可能與乳腺癌細胞的高侵襲性有關。

目前，Transwell侵襲及遷移實驗是檢測腫瘤細胞侵襲與遷移能力的最常用方法。為進一步探討miR-142對乳腺癌細胞侵襲轉移能力的影響，我們在體外應用脂質體轉染法將miR-142模擬物轉染至MDA-MB-231細胞，提高MDA-MB-231細胞中miR-142的表達水平。Transwell侵襲及遷移實驗顯示，轉染后觀察組細胞的侵襲及遷移的穿膜細胞數較對照組明顯減少。這說明上調乳腺癌細胞中miR-142的表達，能夠明顯抑制腫瘤細胞的侵襲轉移能力，進一步表明miR-142在乳腺癌中起抑癌基因的作用。

綜上所述，miR-142在乳腺癌組織和細胞中表達降低，且高侵襲性低于低侵襲性乳腺癌細胞；提高乳腺癌細胞中miR-142的表達水平，能夠抑制細胞的侵襲和遷移能力。但是，乳腺癌的發生發展及侵襲轉移是一個多因素相互作用的復雜過程，miR-142在此過程中的具體作用機制尚需進一步的探討。