網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法在骨碎補(bǔ)治療股骨頭壞死分子機(jī)制研究中的應(yīng)用

駱帝，許波，李剛，梁學(xué)振，蓋帥帥，閻博昭，李嘉程，夏聰敏(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355)

股骨頭壞死(ONFH)是一種常見(jiàn)、難治的骨科疾病，以骨組織結(jié)構(gòu)破壞及力學(xué)性能改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)。ONFH病理機(jī)制尚不完全清楚，誤診誤治或延誤病情可引起關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨塌陷，并繼發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎。雙膦酸鹽類藥物、抗凝藥物、血管擴(kuò)張藥物、調(diào)節(jié)骨代謝藥物等為目前治療ONFH的常用西藥[1]，但其成分和靶向性單一，不能逆轉(zhuǎn)ONFH的疾病進(jìn)展[2]。中醫(yī)治療ONFH以“補(bǔ)腎健骨”為治療原則，以“腎主骨生髓”為組方原則，骨碎補(bǔ)為組方主藥。骨碎補(bǔ)性溫，味苦，歸腎、肝經(jīng)，具有療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效[3]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，骨碎補(bǔ)可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及分化成熟，促進(jìn)股骨頭骨再生、抑制破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨對(duì)鈣的吸收，調(diào)節(jié)血鈣和血磷水平，改善股骨頭內(nèi)環(huán)境[4～6]。骨碎補(bǔ)的分子作用機(jī)制至今尚不明確。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)理論的建立與發(fā)展，中藥潛在活性成分和作用靶點(diǎn)逐漸成為研究熱點(diǎn)。2017年9～10月，本研究通過(guò)篩選和預(yù)測(cè)骨碎補(bǔ)及ONFH的相關(guān)靶點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行富集分析，探討骨碎補(bǔ)治療ONFH可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 骨碎補(bǔ)入血活性成分篩選 通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)[7]，挖掘骨碎補(bǔ)所有成分?jǐn)?shù)據(jù)，根據(jù)成分毒藥物動(dòng)力學(xué)(ADME)參數(shù)[8～10]進(jìn)行篩選。篩選條件[11,12]：藥物口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18；同時(shí)結(jié)合前期研究結(jié)果及跟蹤文獻(xiàn)對(duì)其入血活性成分進(jìn)行完善。

1.2 骨碎補(bǔ)作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建 通過(guò)TCMSP 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)上述入血活性成分的作用靶點(diǎn)，采用網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.2.1[13]對(duì)活性成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中“節(jié)點(diǎn)”表示分子、靶蛋白，“邊”表示成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系；采用network analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，明確骨碎補(bǔ)中較為重要的成分和靶點(diǎn)，結(jié)合文獻(xiàn)分析其中的相互作用。

1.3 已知的ONFH相關(guān)靶點(diǎn)檢索 通過(guò)藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)TTD[14](http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp)、藥物銀行DrugBank[15](https://www.drugbank.ca/)、人類孟德?tīng)栠z傳在線數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM[16](http://www.omim.org/)、遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)GAD[17](https://geneticassociationdb.nih.gov/)、藥物基因數(shù)據(jù)庫(kù)PharmGKB[18](https://www.pharmgkb.org/)等與疾病靶點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)，以“osteonecrosis”作為關(guān)鍵詞對(duì)已知的ONFH相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索及篩選，獲得ONFH發(fā)病過(guò)程中的已知靶點(diǎn)。

1.4 骨碎補(bǔ)治療ONFH的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 使用BisoGenet插件對(duì)上述獲得的入血活性成分及ONFH相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)繪制，采用Cytoscape軟件對(duì)已繪制好的2個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖融合并抽取交集網(wǎng)絡(luò)，即可得到骨碎補(bǔ)治療ONFH的直接和間接靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA[19]并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，借助度中心性(DC)、介度中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)和局部邊連通性(LAC)等指標(biāo)進(jìn)行篩選，其中DC大于所有節(jié)點(diǎn)DC值中位數(shù)2倍的節(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)，即“Big hubs”；然后再篩選其他幾個(gè)指標(biāo)大于所有節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，即關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 骨碎補(bǔ)治療ONFH的機(jī)制分析 采用Pathway富集分析。通過(guò)基因富集分析插件ClueGO[20]對(duì)上述獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，以節(jié)點(diǎn)的形式將結(jié)果以圖像化形式展現(xiàn)；同時(shí)根據(jù)重要程度繪制信號(hào)通路占比餅狀圖，以分析關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的主要信號(hào)通路，研究骨碎補(bǔ)治療ONFH可能的作用機(jī)制。其中，同一種顏色的節(jié)點(diǎn)代表同一類型的信號(hào)通路，節(jié)點(diǎn)的大小代表信號(hào)通路的顯著性，節(jié)點(diǎn)越大說(shuō)明信號(hào)通路的顯著性越高，即該通路的重要性越高。

2 結(jié)果

2.1 骨碎補(bǔ)入血活性成分篩選與ADME分析結(jié)果 本研究通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到骨碎補(bǔ)已報(bào)道的所有入血活性成分共72個(gè)，根據(jù)OB和DL等ADME參數(shù)篩選到入血活性成分18個(gè)。

2.2 骨碎補(bǔ)作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建結(jié)果 本研究利用TCMSP靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)技術(shù)共獲得預(yù)測(cè)靶點(diǎn)92個(gè)；利用網(wǎng)絡(luò)圖形化工具Cytoscape3.2.1得到骨碎補(bǔ)發(fā)揮重要作用的入血活性成分與其對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)的相互關(guān)系共260個(gè)。

2.3 ONFH相關(guān)靶點(diǎn)檢索結(jié)果 共獲得與ONFH發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的已知相關(guān)靶點(diǎn)72個(gè)，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索到2、0、3、46、34個(gè)靶點(diǎn)。

2.4 骨碎補(bǔ)治療ONFH的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選分析結(jié)果

2.4.1 骨碎補(bǔ)治療ONFH的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 與骨碎補(bǔ)入血活性成分產(chǎn)生直接或間接作用的靶點(diǎn)共5 834個(gè)，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系共132 036個(gè)。與ONFH發(fā)病直接或者間接相關(guān)的靶點(diǎn)共2 594個(gè)，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系共59 937個(gè)。

2.4.2 骨碎補(bǔ)治療ONFH的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選分析結(jié)果 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵傩院Y選共發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)治療ONFH的關(guān)鍵靶點(diǎn)92個(gè)。

2.5 骨碎補(bǔ)治療ONFH的機(jī)制分析結(jié)果 對(duì)上述92個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行的Pathway富集分析結(jié)果顯示，骨碎補(bǔ)治療ONFH的關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的信號(hào)通路主要與細(xì)胞周期、炎癥、癌癥等35條顯著富集的信號(hào)通路相關(guān)。

3 討論

目前臨床治療ONFH的方法較多，包括中藥及西藥內(nèi)服外用、保護(hù)性負(fù)重、保髖手術(shù)、介入治療、高壓氧、體外沖擊波和人工關(guān)節(jié)置換術(shù)等。早中期患者多采取非手術(shù)治療手段，晚期患者多首選手術(shù)治療。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎為先天之本，腎主骨，骨生髓，腎精系一身生命的根本，決定人的生長(zhǎng)、發(fā)育與生殖等。ONFH臨床辯證多屬腎精虧虛，所以治法多以補(bǔ)腎為主。骨碎補(bǔ)是水龍骨科植物槲蕨的干燥根莖，是治療ONFH的骨傷科常用中藥[21，22]。機(jī)體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制通常不是單一的信號(hào)通路支配，而是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；不同的信號(hào)通路和靶點(diǎn)之間存在一定程度的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，故藥物的有效成分不單單體現(xiàn)在與成分靶點(diǎn)的直接結(jié)合，而是更多通過(guò)直接、間接的方式與其他靶點(diǎn)結(jié)合。通過(guò)PPI數(shù)據(jù)的構(gòu)建與挖掘，使靶點(diǎn)的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系能清晰可靠地得到呈現(xiàn)。本研究通過(guò)篩選獲得骨碎補(bǔ)中入血的活性成分18個(gè)，并在此基礎(chǔ)上挖掘出92個(gè)可能的靶點(diǎn)和260個(gè)相互關(guān)系。“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”分析顯示，木犀草素、β-谷固醇、山奈酚、豆甾醇、兒茶素、沒(méi)食子酸酯等有效成分能作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)靶點(diǎn)，PRSS1、ESR1、AR等靶點(diǎn)也能與多個(gè)成分形成作用關(guān)系。證實(shí)骨碎補(bǔ)的有效成分之間不僅存在緊密的協(xié)同關(guān)系，而且其作用靶點(diǎn)也在ONFH的疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

本研究Pathway信號(hào)通路富集分析顯示，骨碎補(bǔ)作用于ONFH的關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及的信號(hào)通路主要富集于細(xì)胞周期、炎癥、癌癥相關(guān)等35條信號(hào)通路。①細(xì)胞周期相關(guān)通路。細(xì)胞周期的準(zhǔn)確調(diào)控對(duì)生物體正常的生存、繁殖、發(fā)育和遺傳具有決定性作用[23]。骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡及分化可直接影響骨吸收和骨重建的動(dòng)態(tài)平衡，因此細(xì)胞周期相關(guān)的信號(hào)通路是調(diào)控ONFH發(fā)病機(jī)制中重要的一環(huán)。本研究結(jié)果顯示，骨碎補(bǔ)作用于ONFH的機(jī)制主要富集在Wnt、p53、PI3K/Akt、HIF-1、Notch、DNA復(fù)制、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、核苷酸切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、剪接體、黏合連接及細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路等。Wnt信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化方向和早期的分化潛能，以促進(jìn)更新速度、成骨分化并抑制成脂[24]。p53是公認(rèn)的、與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)分子，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，其在G1期發(fā)揮檢查點(diǎn)的作用，可決定是否啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[25]。研究證實(shí)，p53基因表達(dá)上調(diào)與阻止細(xì)胞凋亡的bcl-2基因下調(diào)共同在ONFH發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[26]。ONFH患者p53基因上調(diào)后可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α) 是生物體內(nèi)最具特征性的低氧反應(yīng)信號(hào)通路。HIF-1α信號(hào)通路在體內(nèi)缺血、缺氧環(huán)境下可改變一系列細(xì)胞功能，使其產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，對(duì)骨形成和血管生成發(fā)揮重要的調(diào)控作用[28]。Notch信號(hào)通路可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化和功能，從而控制骨重建[28]。②炎癥相關(guān)通路。ONFH的病理機(jī)制具有炎癥特性，主要富集于NF-κB信號(hào)通路等。NF-κB受體活化因子配基可直接影響破骨細(xì)胞的形成、分化和骨吸收的調(diào)節(jié)等[29]。③其他有關(guān)信號(hào)通路。骨碎補(bǔ)作用靶點(diǎn)富集分析結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)集群中還覆蓋了EB病毒感染、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、乙醇中毒及癌癥等信號(hào)通路。

綜上所述，骨碎補(bǔ)治療ONFH具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)；其主要通路不僅直接參與骨細(xì)胞的增殖、凋亡及分化，調(diào)節(jié)成骨、破骨代謝平衡，還通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)等干預(yù)和影響骨微環(huán)境，以達(dá)到控制ONFH發(fā)生、發(fā)展的目的。骨碎補(bǔ)調(diào)控ONFH的靶點(diǎn)富集通路存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，治療時(shí)應(yīng)根據(jù)患者和疾病的不同情況，針對(duì)局部關(guān)鍵通路，因人制宜地采用個(gè)性化的多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)療法。

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