Hedgehog-Gli通路在胰腺癌上皮間質轉化中的作用研究進展

張斌，李如月，向曉輝，許威，夏時海

(武警后勤學院附屬醫院，天津300162)

上皮間質轉化(EMT)是指上皮細胞失去極性、細胞間連接而轉變成間質樣細胞的過程，此過程伴有細胞標志蛋白的改變，與胚胎發育、器官纖維化、腫瘤轉移等有關[1，2]。EMT的發生是一個動態調節的過程，轉化生長因子β(TGF-β)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、Hedgehog (Hh) 通路等諸多通路參與其中，且存在廣泛的“串話”，進而引起EMT調節因子Snail、Twist、E盒結合鋅指蛋白(ZEB)等水平變化，最終實現細胞形態和功能的改變[1]。Hh通路有Shh、Ihh和Dhh亞型，前者作用廣泛，后兩者分別主要與軟骨細胞分化及生殖有關，其膜受體包括Ptch、Smo等，本文統稱為Hh通路不再細分。膠質瘤相關癌基因同源蛋白(Gli)家族是Hh信號通路的終末轉錄因子，發揮核心調控作用。脊椎動物中有3種Gli分子：Gli1具有很強的轉錄激活功能，Gli2兼具有轉錄激活和抑制功能，Gli3則發揮轉錄抑制功能[3]。Hh-Gli通路存在于正常的生長發育過程中，異常激活條件下在組織損傷修復、腫瘤發生發展等方面具有重要作用[3，4]。現就Hh-Gli通路及相關分子在胰腺癌EMT過程中的作用綜述如下。

1 胰腺癌中Hh-Gli1對EMT的作用

1.1 Gli1轉錄激活作用的方式 在胰腺癌EMT發生中，Gli1的作用方式有所爭議。多數情況下，同其他高惡性、高轉移的腫瘤一樣，Gli1在胰腺癌患者胰腺及發生轉移的組織中高表達[5,6]，且與EMT發生及細胞侵襲轉移有關。這一點在胰腺癌細胞系中同樣存在。若抑制或沉默Gli1表達會抑制或逆轉胰腺癌EMT的發生，過表達Gli1或Shh蛋白則會促進EMT的進程及胰腺癌的轉移[5～7]。通常Gli1是作用于Snail等轉錄因子來調節EMT的發生，然而，Hh-Gli通路在胰腺癌中分布不均勻，且受基質間Hh配體影響。當突變的KRAS基因激活時，會降低細胞內的Hh通路，使Hh通路的激活局限在基質間，表現為低水平的Gli1引起下游靶基因的激活。這就導致在胰腺導管上皮細胞癌(PDAC)中出現沉默Gli1表達反而促進EMT發生及細胞遷移，且Snail等轉錄因子沒有參與，而是Gli1直接結合到CDH1的啟動子來調控E-鈣黏蛋白的表達；同時，適當降低Gli1水平還可增強TGF-β誘導的EMT及細胞遷移，提示低水平的Gli1同樣有助于PDAC的高轉移[8]。此外，研究發現，僅僅沉默Gli1表達并不能影響EMT發生，但Gli1的沉默可促進TGF-β1和表皮生長因子(EGF)誘發的EMT過程。可見，Gli1對胰腺癌EMT的調節是多種形式的，這可能與胰腺癌的類型、階段、細胞的狀態、患者其他情況等因素有關，具體的調節機制還需相關研究加以驗證。

1.2 藥物對Gli1的干預作用 諸多中藥成分，如姜黃素、葛杜寧、白藜蘆醇等[7,9,10]可以通過抑制Gli1表達進而抑制EMT發生，發揮抗腫瘤作用。TGF-β1及低氧是常見的EMT誘導因素，它們可以誘導胰腺癌Panc-1細胞發生EMT改變，促進細胞侵襲遷移，同時伴有Hh-Gli1通路的激活；姜黃素作用后則明顯抑制了EMT的發生及Shh、Gli1表達[9,10]。胰腺癌等惡性腫瘤的中央區域是一個缺氧的微環境，低氧誘導了低氧誘導因子1α(HIF-1α)和活性氧(ROS)的產生，激活Hh-Gli1通路，誘導EMT發生及MMP-2表達，促進胰腺癌的侵襲轉移；白藜蘆醇對此過程也具有明顯的抑制作用[11]。低氧產生的HIF-1α還可以通過非經典途徑激活Gli1，Panc-1、BxPC-3細胞發生EMT及促進胰腺癌細胞侵襲[12]。在胰腺癌生長方面，垂盆草提取物可通過抑制Hh-Gli1通路來抑制細胞生長周期及EMT的發生，減慢Panc-1細胞的繁殖[13]。在化療藥物抗癌機制研究上，吉西他濱聯合Hh通路抑制劑維莫德吉(GDC-0449)可明顯抑制Gli1及ZEB1的表達，通過抑制EMT來抑制PDAC的增殖和轉移[14]。

1.3 其他分子對Gli1的干預作用 某些蛋白或因子在Hh-Gli1介導的胰腺癌EMT發生中也發揮重要的調控作用，如S100A4蛋白、β1-整合素、基質細胞蛋白CCN1/Cyr61、基質細胞衍生因子1(SDF1)、黏蛋白MUC5AC等[15]。多因素調控產生了信號通路間的“串話”，CNN1/Notch1通路、SDF1/CXCR4通路都可以引起Gli1的活化進而誘導PDAC發生EMT。纖維蛋白等細胞外基質的過度沉積，為PDAC的發展提供適合的微環境。研究[16]發現，腫瘤相關成纖維細胞(CAF)與Panc-1、BxPc-3共培養，可導致CAF中Gli1及胰腺癌細胞中Snali高表達，促進EMT發生及胰腺癌轉移。基質中的Ⅰ型膠原纖維還可以通過激活β1-整合素引起Gli1的激活，誘導EMT發生，促進細胞增殖、侵襲及轉移。癌細胞周圍大量增生的基質也產生了豐富的促炎因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)等。這些促炎因子通過激活經典及非經典的Hh-Gli1通路上調Gli-1的表達，促進PDAC中EMT的發生及細胞侵襲轉移[17]。研究[6, 18]發現，Hh-Gli1通路調節的胰腺腫瘤干細胞(PCSCs)對胰腺癌的增殖具有促進作用，同時Gli1可使PCSCs發生EMT，促進細胞的侵襲轉移[18]。胰腺癌中Hh-Gli1通路及EMT相關性的充分研究，對于胰腺癌發生發展及診治預后的認識具有重要意義。

2 胰腺癌中Hh-Gli2對EMT的作用

與Gli1相比，Gli2除具有轉錄激活作用外，還具有較弱的轉錄抑制作用，但對抑制作用的研究很少。研究[19]認為，Gli2的激活作用可以通過調節Gli1表達實現，二者的激活作用也可以重疊。PCSCs在胰腺癌的生長、復發、早期轉移中發揮重要作用，且與Hh-Gli1/2通路的異常激活關系密切。Gli轉錄抑制劑GANT-61可通過抑制Gli1/2的表達，上調E-鈣黏蛋白的表達同時下調N-鈣黏蛋白、Snail等表達來抑制EMT發生，從而抑制PCSCs轉移[19]。Sharma等[20]發現，Hh-Smo-Gli通路中Smo抑制劑NVP-BEZ-235可降低PCSCs及胰腺癌動物模型中Gli1/2的表達從而抑制EMT發生，并且存在PI3K-AKT-mTOR通路的“串話”；而恩貝酸同樣通過抑制Hh-Gli1/2及PI3K-Akt通路抑制胰腺癌細胞系、PCSCs及動物模型中EMT發生及MMP-2/9表達，以抑制胰腺癌的轉移[21]。此外，茶多酚(EGCG)也可以通過抑制Gli1/2的轉錄，抑制PCSCs 的EMT及侵襲轉移；槲黃素對此有協調作用，且可能存在Wnt/β-catenin/TCF通路的“串話”[22]。在給予蘿卜硫素治療的植入PCSCs的小鼠腫瘤組織發現，Gli1/2表達降低，同時EMT及癌細胞早期轉移受到抑制[23]。類似的研究還見于α-山竹黃酮通過抑制Hh-Gli1/2通路抑制CSCs的EMT發生及侵襲遷徙，動物模型中表現為胰腺癌肝轉移受到抑制[24]。激活的Gli2還可通過上調黏蛋白MUC5AC以降低E-鈣黏蛋白的表達，促進胰腺癌細胞的侵襲轉移[25]。同Gli1一樣，適當條件下，沉默Gli2表達也可以促進PDAC中EMT的發生[8]。從上述研究中不難發現，Hh-Gli2通路同Hh-Gli1通路一樣在胰腺癌EMT及侵襲轉移中發揮重要作用，但對于Gli2與Gli1發揮激活作用的關系上及Gli2在胰腺癌EMT中的轉錄抑制作用還需進一步研究。

3 胰腺癌中Hh-Gli3對EMT的作用

作為轉錄抑制因子，對Gli3的研究極少。在人正常胰腺導管上皮細胞HPNE中過表達Shh蛋白可誘導EMT的發生，伴有細胞遷移能力的增強；同時，Shh可能通過刺激胰腺成纖維細胞上調Ptch進而增加胞質中Gli3的表達，而Gli3直接抑制了E-鈣黏蛋白的表達以促進EMT發生[25]。增加Gli3表達還可以下調PDAC中E-鈣黏蛋白表達，其原因可能是Gli3占據了CDH1啟動子上Gli1的結合位點，相當于減少了Gli1對E-鈣黏蛋白表達的直接激活，這個結果與沉默Gli1誘導PDAC發生EMT的結果相照應[8]。可見，無論是哪種Gli分子的上調都可以誘導胰腺癌中EMT的發生，3種Gli分子間的協調促進了胰腺癌的侵襲轉移。

胰腺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，死亡率以每年0.3%的速度增長，5年生存率雖有所增加，但仍僅為8%[26]。根治性手術仍是目前最有效的治療方式，然而多數患者就診時已發生轉移。因此，弄清胰腺癌的轉移機制對胰腺癌患者的靶向治療及預后有著重要的意義。EMT是胰腺癌轉移的重要機制，受包括Hh-Gli在內的多種信號通路調節，阻斷這些關鍵分子可能為胰腺癌治療提供新的靶點。

[1] Nieto MA, Huang RY, Jackson RA, et al. EMT: 2016[J]. Cell, 2016,166(1):21-45.

[2] 彭釗,鄺學軍,王建鈞,等.生長抑素對人肝癌細胞上皮間質轉化的抑制作用[J].山東醫藥,2016,56(24):29-31.

[3] Gonnissen A, Isebaert S, Haustermans K. Targeting the Hedgehog signaling pathway in cancer: beyond Smoothened[J]. Oncotarget, 2015,6(16):13899-13913.

[4] Tang C, Mei L, Pan LY, et al. Hedgehog signaling through GLI1 and GLI2 is required for epithelial-mesenchymal transition in human trophoblasts[J]. Biochim Biophys Acta, 2015,1850(7):1438-1448.

[5] Feldmann G, Dhara S, Fendrich V, et al. Blockade of hedgehog signaling inhibits pancreatic cancer invasion and metastases: a new paradigm for combination therapy in solid cancers[J]. 2007,67(5):2187-2196.

[6] Hao K, Tian X, Qin C, et al. Hedgehog signaling pathway regulates human pancreatic cancer cell proliferation and metastasis[J]. Oncol Res, 2013,29(3):1124-1132.

[7] Subramani R, Gonzalez E, Nandy SB, et al. Gedunin inhibits pancreatic cancer by altering sonic hedgehog signaling pathway[J]. Oncotarget, 2017,8(7):10891-10904.

[8] Joost S, Almada LL, Rohnalter V, et al. GLI1 inhibition promotes epithelial-to-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells[J]. Cancer Res, 2012,72(1):88-99.

[9] Sun XD, Liu XE, Huang DS, et al. Curcumin reverses the epithelial-mesenchymal transition of pancreatic cancer cells by inhibiting the Hedgehog signaling pathway[J]. Oncol Rep, 2013,29(6):2401-2407.

[10] Cao L, Xiao X, Lei JL, et al. Curcumin inhibits hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells via suppression of the hedgehog signaling pathway[J]. Oncol Rep, 2016,35(6):3728-3734.

[11] Li W, Cao L, Chen X, et al. Resveratrol inhibits hypoxia-driven ROS-induced invasive and migratory ability of pancreatic cancer cells via suppression of the Hedgehog signaling pathway[J]. Oncol Rep, 2016,35(3):1718-1726.

[12] Lei J, Ma J, Ma Q, et al. Hedgehog signaling regulates hypoxia induced epithelial to mesenchymal transition and invasion in pancreatic cancer cells via a ligand-independent manner[J]. Mol Cancer, 2013,12:66.

[13] Bai Y, Chen B, Hong W, et al. Sedum sarmentosum Bunge extract induces apoptosis and inhibits proliferation in pancreatic cancer cells via the hedgehog signaling pathway[J]. Oncol Res, 2016,35(5):2775-2784.

[14] Karaca M, Dutta R, Ozsoy Y, et al. Micelle mixtures for co-administration of gemcitabine and GDC-0449 to treat pancreatic cancer[J]. Mol Pharm, 2016,13(6):1822-1832.

[15] Inaguma S, Kasai K, Ikeda H. GLI1 facilitates the migration and invasion of pancreatic cancer cells through MUC5AC-mediated attenuation of E-cadherin[J]. Oncogene, 2011,30(6):714-723.

[16] Shan T, Chen S, Chen X, et al. Prometastatic mechanisms of CAF-mediated EMT regulation in pancreatic cancer cells[J]. Int J Oncol, 2017,50(1):121-128.

[17] Wang Y, Jin G, Li Q, et al. Hedgehog Signaling non-canonical activated by pro-inflammatory cytokines in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. J Cancer, 2016,7(14):2067-2076.

[18] Wang F, Ma L, Zhang Z, et al. Hedgehog signaling regulates epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer stem-like cells[J]. J Cancer, 2016,7(4):408-417.

[19] Fu J, Rodova M, Roy SK, et al. GANT-61 inhibits pancreatic cancer stem cell growth in vitro and in NOD/SCID/IL2R gamma null mice xenograft[J]. Cancer Lett, 2013,330(1):22-32.

[20] Sharma N, Nanta R, Sharma J, et al. PI3K/AKT/mTOR and sonic hedgehog pathways cooperate together to inhibit human pancreatic cancer stem cell characteristics and tumor growth[J]. Oncotarget, 2015,6(31):32039-32060.

[21] Huang M, Tang SN, Upadhyay G, et al. Embelin suppresses growth of human pancreatic cancer xenografts, and pancreatic cancer cells isolated from Kras G12D mice by inhibiting Akt and sonic hedgehog pathways[J]. PLoS One, 2014,9(4): e92161.

[22] Tang SN, Fu J, Nall D, et al. Inhibition of sonic hedgehog pathway and pluripotency maintaining factors regulate human pancreatic cancer stem cell characteristics[J]. Int J Cancer, 2012,131(1):30-40.

[23] Li SH, Fu J, Watkins DN, et al. Sulforaphane regulates self-renewal of pancreatic cancer stem cells through the modulation of Sonic hedgehog-GLI pathway[J]. Mol Cell Biochem, 2013,373(1-2):217-227.

[24] Verma RK, Yu W, Shrivastava A, et al. α-Mangostin-encapsulated PLGA nanoparticles inhibit pancreatic carcinogenesis by targeting cancer stem cells in human, and transgenic (Kras(G12D), and Kras(G12D)/tp53R270H) mice[J]. Sci Rep, 2016,6:32743.

[25] Bailey JM, Mohr AM, Hollingsworth MA, et al. Sonic hedgehog paracrine signaling regulates metastasis and lymphangiogenesis in pancreatic cancer[J]. Oncogene, 2009,28(40):3513-3525.

[26] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2017,67(1):7-30.