結直腸癌組織TGF-β1表達水平與腫瘤細胞免疫逃逸的關系

解廣東，王本軍，韓瑋瑋，白克運

(1山東中醫藥大學，濟南250014；2山東中醫藥大學附屬醫院)

在我國，結直腸癌的發病率、病死率分別高居惡性腫瘤第3位和第5位，嚴重威脅著國民的健康[1]。目前，結直腸癌的治療以外科手術為主，并采用化療、放療、靶向治療等多學科的綜合治療，其術后5年生存率不斷提高，但仍有較多患者術后因復發轉移而死亡。一項包含18個臨床試驗的薈萃分析表明，結直腸癌患者術后8年隨訪期內復發率高達35%[2]，而Ⅰ～Ⅲ期患者結直腸癌根治術后因復發或轉移死亡者占5%～35%[3]。其中，結直腸腫瘤細胞的免疫逃逸在術后復發轉移中起到了重要作用。因此，研究結直腸腫瘤細胞的免疫逃逸機制，降低結直腸癌患者術后復發轉移率成為亟待解決的問題。轉化生長因子β1(TGF-β1)是由機體多種細胞分泌產生并可介導其抑制效應的一種細胞負性免疫調節因子，可抑制免疫T細胞的增殖及分化，調節細胞表型，抑制T細胞活性及其他因子產生，導致免疫功能低下，廣泛參與多種疾病的發生及發展[4]。目前，對TGF-β1在結直腸腫瘤術后免疫逃逸中的作用機制認識尚不深入，與結直腸癌復發轉移的相互關系研究尚不足。本研究通過檢測并對比結直腸癌與癌旁組織、術后復發與未復發患者TGF-β1表達情況，分析復發患者TGF-β1表達水平與無瘤生存期的關系，探究TGF-β1與免疫逃逸的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年2月～2014年8月于山東中醫藥大學附屬醫院肛腸科住院并行手術治療的符合下述納入及排除標準的結直腸癌患者手術切除的組織樣本。納入標準：①臨床資料完整，年齡18～80歲；②病理明確診斷為原發性結腸癌或直腸癌；③術前未接受放療、化療等其他抗腫瘤治療。排除標準：①有廣泛腫瘤轉移；②合并消化道梗阻、出血或穿孔等急癥手術者；③合并肝、腎、造血系統、心腦血管疾病等。本研究共納入符合要求的患者139例，根據隨訪期內有無復發轉移將患者分為復發組和未復發組。其中復發組47例，男28例、女19例，年齡(53.7±17.3)歲，TNM分期Ⅱ期21例、Ⅲ期26例；未復發組92例，男57例、女35例，年齡(55.2±14.5)歲，TNM分期Ⅱ期42例、Ⅲ期50例。兩組性別、年齡及TNM分期等方面均無顯著差異；同時術中留取60例患者癌組織邊緣5 cm之外的癌旁正常組織。本研究已獲山東中醫藥大學附屬醫院倫理委員會審核批準，患者本人或家屬簽署知情同意書。

1.2 TGF-β1檢測方法 采用免疫組化法。將所有切除后新鮮標本固定在10%甲醛固定液中，取出標本，經脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后，切片，片厚4 μm，烤干后保存備用；測定時進行二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化，3%過氧化氫-甲醇溶液浸泡滅活內源性過氧化物酶，枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)下微波修復抗原；以正常山羊血清封閉非特異性抗原后,滴加兔抗人TGF-β1單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司，工作液濃度為1∶500)、生物素化二抗；各步驟間均以0.01 mol/L PBS緩沖液沖洗，嚴格按照說明控制時間和溫度；DAB 顯色、蘇木精輕微襯染、脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照，觀察結直腸癌組織及癌旁組織的染色情況。 TGF-β1陽性物質均定位在腫瘤細胞以及間質淋巴細胞的細胞質。采用HIPAS100圖像分析軟件對所有切片進行圖像分析，先于低倍鏡尋找每張切片著色的典型區域，根據不同的染色強度可觀察到無色、黃色、棕黃色、棕褐色等色差，代表TGF-β1的不同表達強度；在每張切片典型區域內隨機選取10個不重復的視野，放大400倍鏡下測量每個視野下的陽性灰度單位，取其均數即為TGF-β1表達水平。

1.3 腫瘤復發或轉移觀察方法 患者均于術后開始隨訪，定期復查。如臨床懷疑腫瘤復發或轉移，復查血清腫瘤標志物(CEA、CA199等)，并行結腸鏡檢查、胸腹盆腔CT掃描，必要時可行PET-CT檢查來判定結直腸癌復發或轉移，記錄復發患者的無瘤生存時間；隨訪終點為確認腫瘤復發轉移或患者死亡或隨訪期滿3年[5]。

2 結果

2.1 TGF-β1在結直腸癌與癌旁組織中的表達情況 TGF-β1在結直腸癌組織中表達量為22.53±5.98，高于癌旁組織中的14.58±3.19 (P<0.05)。

2.2 TGF-β1在復發組與未復發組結直腸癌組織中的表達情況 復發組結直腸癌組織中TGF-β1表達量為26.19±6.05，高于未復發組的20.80±5.03(P<0.05)。

2.3 TGF-β1表達水平與無瘤生存期的關系 47例出現復發轉移的結直腸癌患者，其無瘤生存期為(21.36±7.12)個月；經Spearman相關性分析，TGF-β1表達水平與無瘤生存期呈顯著負相關(r=-0.419，P<0.05)。

3 討論

腫瘤的免疫逃逸是一個多因素、多步驟的復雜過程，機體的免疫監視系統被抑制在逃逸過程中發揮著極其重要的作用，為腫瘤的生長、浸潤及復發轉移提供了必備的條件，成為不可忽視的重要因素[6]。隨著免疫學、分子生物學、基因技術研究的不斷深入，多種免疫分子、細胞因子逐漸被了解，成為腫瘤治療、預后評估的新指標。近年來，多個臨床研究[7,8]表明，在腫瘤的形成及復發轉移過程中，除了細胞癌基因的活化及抑癌基因的失活之外，腫瘤細胞可以通過上調TGF-β1表達水平，以逃脫機體的免疫監視及抑制機體的免疫功能而確保其自身的發生發展。

TGF-β1是具有雙向調節功能的多效細胞因子，在腫瘤細胞免疫逃逸及免疫抑制過程中發揮著重要的負性調節作用。作為細胞信號轉導通路中的重要部分，既可通過旁分泌又可通過自分泌調節機體細胞行為。在正常組織及癌變早期，TGF-β1通過負性調控效應，使細胞增殖停留在G1期而不進入S期，抑制細胞周期而防止過度增殖；同時，TGF-β1可誘導上皮細胞分化或凋亡，維持細胞正常的極性和細胞間黏附能力，減少上皮細胞間質化的發生，從而發揮抑癌因子的作用[9，10]；然而，在細胞信號轉導過程中，轉導通路任何組分的突變，都可引起信號的傳遞發生改變，使機體細胞逃避TGF-β1介導的抑癌作用，并促進成纖維細胞因子的釋放，導致腫瘤的發生。腫瘤發展期，由于細胞信號轉導通路的因子發生變異，細胞開始抵抗TGF-β1的生物學作用，導致抑制細胞周期的作用消失，腫瘤細胞逐漸生長，并反饋性地增加TGF-β1的分泌，引起TGF-β1的表達水平升高。隨著腫瘤發展，TGF-β1表達水平在腫瘤細胞的微環境中進一步上調，并可通過抑制CD8+、CD4+T細胞，破壞了機體T細胞介導的細胞毒作用，誘導機體產生免疫抑制，進而減弱人體的免疫監視和免疫殺傷能力[11]；同時，TGF-β1持續地刺激細胞從貼壁依賴性生長向貼壁非依賴性生長的轉化，上皮細胞向間質細胞轉化。在此過程中，上皮細胞失去極性，細胞的可塑性升高，細胞間黏附能力下降，逐漸從基底膜上脫落，并獲得間質細胞表型以及運動和侵襲能力；最終導致癌變細胞逃脫免疫監視，逐漸生長或脫離原發瘤進入血液循環[12]。此外，上調的TGF-β1水平亦通過降低腫瘤細胞表面抗原的表達，使其逃脫免疫系統的識別和殺傷,引起腫瘤細胞的生長、復發及轉移[13]。Li等[14]研究表明，TGF-β1/Smad4的MH2結構域突變，引起蛋白的核心結構被破壞，無法形成Smads蛋白復合體，阻滯了受體依賴的R-Smad磷酸化過程；或產生不穩定的Smads蛋白，使得TGF-β1對腫瘤細胞無法發揮有效的抑制作用，造成腫瘤細胞的逃逸；而腫瘤細胞系中TGF-β1的基礎水平能夠影響其生長，TGF-β1上調水平與轉移相關，高水平TGF-β1/Smads 通路在腫瘤的免疫逃逸方面起著促進作用。

本研究結果亦表明，結直腸癌組織中TGF-β1表達水平明顯高于正常癌旁組織，復發者TGF-β1表達水平亦明顯高于未復發者，且復發者癌組織TGF-β1水平與術后無瘤生存時間呈負相關。這些皆與TGF-β1抑制機體的免疫系統，促進免疫逃逸有關。因為TGF-β1在正常組織及結直腸腫瘤前期，作為一種免疫調節分子，正常水平的表達，能調控機體的免疫功能，發揮抗腫瘤的功效；而在發生結直腸腫瘤時，反饋機制發揮作用，促進TGF-β1異常升高；術中切除腫瘤組織，可有效降低局部組織中TGF-β1水平，減輕TGF-β1對機體的免疫抑制。而組織中TGF-β1表達水平相對較高者仍能受其影響，并繼續通過不同的途徑抑制宿主免疫活性細胞，發揮免疫抑制，促進腫瘤細胞較早地逃脫免疫監視，導致患者腫瘤復發[15]。

綜上所述，結直腸癌組織通過上調TGF-β1表達而抑制機體的免疫功能，而高表達的TGF-β1又下調了腫瘤細胞表面抗原的表達，幫助腫瘤細胞逃脫機體的免疫監視，增強了腫瘤免疫逃逸的能力，引起結直腸癌患者的復發轉移。從理論上講,探索有效的干預途徑,下調機體TGF-β1的表達，恢復正常的免疫功能，可以有效降低結直腸癌患者的復發轉移率。因此，如何恢復正常的TGF-β1表達水平，并通過其表達的水平評估結直腸癌患者的預后,準確區分高危患者,已成為進一步提高結直腸癌生存率的關鍵及治療的新思路。

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