果糖致HepG2細胞脂質沉積及ATF-4敲除的保護作用

任路平 于賢 王娜 劉娜 宋光耀 陳樹春

河北省人民醫院內分泌科（石家莊 050000）

近年，人群中含果糖的軟飲料如可樂、果汁等的攝入量逐年增加，果糖對肝臟脂質沉積的影響已逐漸被認識。果糖主要在肝細胞內代謝，我們的既往動物研究證明高果糖飲食可引起脂肪肝，并且和肝內質網應激有關［1-3］。激活轉錄因子4（ATF-4）是內質網應激中非折疊蛋白反應PERK-eIF2α-ATF-4通路的下游因子，已有研究發現ATF-4具有調節脂代謝的作用［4-5］，但目前國內尚無研究觀察ATF-4在果糖致肝臟脂質沉積中的作用，探討ATF-4對果糖所致肝脂質沉積的作用有助于進一步探索果糖對脂代謝的危害及內質網應激在脂肪肝中的介導機制。故本研究通過敲低ATF-4在HepG2細胞的表達，探討果糖致HepG2細胞脂質沉積中ATF-4的介導作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及轉染 人肝腫瘤系HepG2細胞（江蘇省江陰康眾康民生物醫藥技術有限公司，批號：HUCL-0085）用含10%FBS，1%NEAA的MEM培養液于37℃含5%CO2的溫箱中培養，待細胞80%生長融合。將處于對數生長期的細胞消化后，用含10%FBS，1%NEAA的MEM培養液調整細胞密度為106個/L，轉入孔板中，將ATF小干擾RNA（SiRNA）（Santa Cruz，CA，USA）轉染致HepG2細胞。

1.2 細胞分組 根據不同處理將細胞分為正常對照組（C組，普通培養基培養HepG2細胞組）；高果糖組（F組，含20 mmol/L果糖的培養基培養的HepG2細胞組）；高果糖+陰性對照組（F+NC組，含20 mmol/L果糖的培養基培養的HepG2細胞轉染空白對照質粒組）；高果糖+ATF-4 siRNA組（F+ATF-4 siRNA組，含20 mmol/L果糖的培養基培養的HepG2細胞轉染ATF-4 siRNA組）。

x代表基帶信號，M代表幾進制調制，本文的M取2和4。調制信號產生以后，再給調制信號加上高斯噪聲，模仿信號傳輸過程中的干擾。把調制信號加上高斯噪聲的函數如下：

1.3 HepG2細胞甘油三酯測定 收集細胞，制備細胞懸液，將細胞懸液1 000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細胞沉淀；按照甘油三酯測定試劑盒（普利萊基因技術有限公司）提供的操作方法，采用GPO-PAP法測定HepG2細胞內甘油三酯含量。

1.6 HepG2細胞的蛋白表達測定 本實驗應用Western Blot方法測定了ATF-4及下游脂質合成的關鍵酶類脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、硬脂酰CoA去飽和酶（SCD-1）的蛋白表達水平。提取HepG2細胞總蛋白，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，經過轉膜、封閉，加入1∶1 000～1∶2 000稀釋的抗體，4℃搖床過夜，TTBS緩沖液洗膜后加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體孵育1 h，經化學發光，顯影，定影及蛋白表達半定量分析。FAS抗體購于Santa Cruz公司，SCD-1、ACC、ATF-4抗體購于美國Cell Signal Technology公司，抗β-actin小鼠單克隆抗體購于SAB公司。

2.1 轉染ATF-4 siRNA對ATF-4蛋白表達的影響 F組ATF-4表達較C組顯著升高（P＜0.01），提示果糖刺激引起HepG2細胞內質網應激通路PERK-eIF2α-ATF-4的激活。F+ATF-4 siRNA組ATF-4的表達水平比F組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01），說明ATF-4表達水平被有效抑制（圖1）。