乳酸菌作為DNA疫苗載體的研究進展

易德瑋，羅 玲，楊坤明，韓奇鵬

（湖南正虹科技發展股份有限公司，湖南 岳陽 414418）

隨著對疫苗傳遞系統的深入研究，科學工作者們期望找到一種能在機體體內較長時間存在、且對機體本身安全又能產生持續免疫力的傳遞載體，而乳酸菌是一類食品級、非侵襲及非致病性的微生物，是動物胃腸道常在菌群，將其作為載體系統來表達外源蛋白有著不可替代的優點[1-2]。科學工作者們試圖利用其定植腸道發揮表達抗原的黏膜免疫效果的特點而應用在疫苗的研發中[3-4]。近年來，乳酸菌質粒載體系統、食品級載體及電穿孔轉化技術發展迅速，以乳酸菌作為研制載體疫苗成為可能[5]。本文就乳酸菌作為DNA疫苗載體進行綜述。

1 DNA疫苗

DNA疫苗是編碼免疫原或與免疫原相關因子的真核表達質粒DNA或RNA，是20世紀90年代初出現的繼減毒疫苗、基因工程疫苗后的第三代新型疫苗，具有免疫效果好、容易制備、生產成本低、臨床應用方便等優點[6]。DNA疫苗經多種接種途徑進入動物體內，被動物宿主細胞攝取后能轉錄和翻譯表達出的抗原蛋白通過刺激機體產生非特異性和特異性兩種免疫應答反應，從而起到免疫保護作用。據報道埃博拉病毒、瘧疾、艾滋病和腫瘤等DNA疫苗已相繼通過美國食品藥品監督管理局（FDA）批準進入臨床試驗[7-8]。

DNA疫苗的優點：比傳統疫苗安全、穩定性好、用量少且效果好[6,9]。盡管DNA疫苗與弱毒疫苗免疫原性相當，但是DNA序列編碼的僅是單一的一段病毒基因，基本沒有毒性逆轉的可能，故不存在減毒疫苗毒力回升的致病危險[10]。DNA疫苗生產成本低廉，貯存方便，且適于大批量生產[11]。DNA接種載體（如質粒）的結構簡單，提純質粒DNA的工藝簡便，并且DNA分子克隆較容易，故DNA疫苗可根據需要隨時進行更新，此外，質粒本身可作為佐劑，故不需額外再加佐劑[12]。相較于原核表達，DNA疫苗可以在遞送病毒或寄生蟲抗原的過程中，對抗原表位進行翻譯后的糖基化加工，這對某些抗原表位的構象非常重要，而原核表達系統中沒有糖基化過程，因此更適用于原核病原菌。

DNA疫苗的不足之處：DNA疫苗作為基因調控的方式，附帶的外源基因也被導入機體后，該外源基因可能會激活宿主內源性原癌基因或使宿主抑癌基因失活，會使疫苗具有較低的免疫原性，還能引發機體產生抗DNA抗體，目前研究人員們暫時沒檢測出DNA疫苗相關基因組整合到宿主細胞中[13-14]。

2 乳酸菌表達系統的特點

Pouwels等試驗發現，乳酸桿菌表達系統可將外源蛋白表達于菌體細胞內，外源蛋白分泌效率高有利于促進局部或全身黏膜免疫反應，表明乳酸桿菌作為活菌的疫苗抗原載體能夠表現出較高的安全性[15]。乳酸菌作為一種原核表達系統，在保證機體安全的前提下，能夠發揮持續且高效的免疫力，該菌之所以能作為極具開發前景的理想抗原呈遞載體，有以下特點：易培養，且某些菌種自帶染色體外因子可構建出新的表達載體系統；遺傳操作方法簡便、且重復性好、效率高；乳酸菌安全性較高，表達的外源蛋白無需進行純化，便可直接連同菌體一起服用；具有高度且可調控的啟動子系統，能表達毒素基因；能保障基因工程產品的相對安全性，構建出可供直接口服的食品級表達系統，如糖誘導表達系統，乳鏈球菌素調控表達系統，噬菌體Φ31爆發式誘導的表達系統，pH調控表達系統等；能有效刺激機體產生免疫反應和免疫耐受，且持續時間較長；外源蛋白在細胞內外均可獲得良好的表達效果[16-17]。

3 乳酸菌在DNA疫苗中的作用機理

乳酸菌一直被應用于食品發酵和保存中,屬于食品級的細菌，其本身可作為DNA疫苗載體，因無侵入能力，故其遞送DNA的能力不強，而減毒沙門菌這類弱致病菌由于可侵入到細胞中，因此可以能更好的遞送DNA，因此通過模擬病原菌的侵入過程，應用基因克隆、遺傳修飾等方法構建侵入型重組乳酸菌，可以使其具有更好的遞送能力。根據乳酸菌質粒載體上啟動子類型的不同，可將其分為組成型表達載體和誘導型表達載體，乳鏈菌肽誘導表達載體是目前最具應用前景的乳酸菌誘導型表達載體，已成功地表達了同源或異源的菌體蛋白、酶類、膜蛋白、細菌素及某些抗原類等[18-19]。另外，疫苗載體菌株的不同會影響重組乳酸菌疫苗的免疫效果[20-21]。主要是因為不同乳酸菌在胃腸道存活率、體內定植狀況、免疫調節功效及其與GALT的作用方式等方面均存在差異，而乳酸乳球菌作為表達外源蛋白的理想菌株有其獨特優勢，經實踐證明是較安全的，其自身分泌蛋白較少[22]。此外，由于乳酸乳球菌不屬于人和動物的共生菌群，基本不在胃腸道內定植，可避免定植而導致的免疫耐受[4,23]。

4 乳酸菌在DNA疫苗中的作用研究進展

乳酸乳球菌可以大量產生并遞送抗原及細胞因子，時下已成為口服DNA疫苗的運載工具。為了增加DNA的遞送能力，研究人員試圖通過改造乳酸菌使其成為具有侵入能力的乳酸菌。金黃色葡萄球菌是一種具有侵入宿主細胞能力的病原菌，經研究表明其細菌表面表達的纖連蛋白結合蛋白A（Fn?BPA）對其侵入能力起著絕對重要的作用[24]。由此可知在乳酸乳球菌中表達外源FnBPA后會使乳球菌本身獲得侵入細胞的能力，另外，新型質粒pV?alac也可在乳酸菌中進行表達，從而作為構建真核DNA疫苗的一種載體，該新型質粒由來自牛生長激素（BGH）中的聚腺苷酸化序列（polyA）和巨細胞病毒啟動子（pCMV）兩部分組成。Guimar?es等將帶有綠色熒光蛋白（GFP）的pValac質粒分別轉染至PK15及Caco-2細胞中并得到相應的表達[25]。鑒于乳酸乳球菌沒有定植能力，因此只能在黏膜水平上對蛋白質進行加工和傳遞[26]。同時使乳酸乳球菌在體內和體外均能將功能完整的質粒遞送到真核細胞中[27]。懷著進一步提高乳酸菌的細胞侵入能力的目標，科學工作者們已在乳酸乳球菌中表達了外源蛋白Fn?BPA和InIA（產單核細胞內化蛋白），并通過體內試驗和體外試驗檢測到FnBPA及InIA的表達情況，該研究結果表明外源侵入型蛋白的表達可有效增強乳酸菌的侵入能力，與表達FnBPA的乳酸菌菌株FnBPA+是體內傳遞質粒的最佳選擇載體的研究結果吻合[28]。另外，研究表明，FnBPA或InIA的乳酸乳球菌不僅在體內的胃腸道中還在體外細胞中，都能提高質粒的轉移效率[29]。乳桿菌屬植物乳桿菌為乳酸菌中另一典型的菌種，定植于胃腸道，相較于乳酸乳球菌，其耐受胃酸和膽鹽的能力更強，能更好地在消化道存活,且菌體自身具有較強的免疫刺激功效,該菌具有免疫調節和佐劑的特性[4,30]。研究表明，該植物乳桿菌能對醫學上重要的蛋白質進行修飾，并能以多種方式對其進行表面錨定，基于乳酸菌能將cDNA遞送到宿主細胞。Michon等為了提高植物乳桿菌遞送DNA的能力，構建了表面錨定表達針對樹突狀細胞（DCs）表面的受體DEC-205的重組單鏈抗體（aDec）的植物乳桿菌，其特異性抗體在乳桿菌表面表達能增強乳桿菌對DC的靶向作用及結合能力，因而提高cDNA向DC的傳遞能力[31]。且在體外的細胞中或在體內的胃腸道中，重組單鏈抗體在菌種表面上的表達都能提高質粒由乳酸菌進入到樹突狀細胞的傳遞效率。

5 小結

乳酸菌作為DNA疫苗載體具有很好發展前景和研究價值，關于乳酸菌作為疫苗載體已有20多年發展歷史，主要是使用乳酸菌作為外源蛋白載體對機體進行免疫，從而抵抗通過消化道和呼吸道黏膜進入體內的病原體，在乳酸菌中還有許多隱蔽性質粒存在，需要深入研究[32-33]。目前可用于構建疫苗的載體菌株僅限于乳酸球菌和乳酸桿菌屬中的幾個菌株,表達的抗原蛋白僅限于幾種,構建成功的疫苗也不多，因此開發更多、更有效的疫苗載體株，構建更多、更有效的疫苗是今后的研究方向。