豬細小病毒VP2重組蛋白的誘導表達及表達產物的純化

孫 超，高 瑩，丁 晨，佟 洋，范 慧，張宏玲

（吉林農業科技學院動物科技學院 132101）

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)屬于細小病毒科細小病毒屬，是一種自主復制型病毒，臨床常以妊娠母豬流產、死胎、畸形胎、胎兒木乃伊化及弱仔等一系列癥狀為特征。豬細小病毒病常與其他導致母豬繁殖障礙的病原混合感染而致病，給養豬業帶來了嚴重的損失[1-2]。目前國內外針對豬細小病毒病的診斷有很多方法，其中以全病毒為檢測抗原的免疫學方法較常用,但由于全病毒在檢測應用過程中有很強的感染性，且其生產和純化技術要求較高。因此應用重組蛋白來檢測豬細小病毒病顯得尤為重要。鑒于此，本研究利用表達載體pET-SUMO在大腸桿菌中對VP2重組蛋白表達，并經過濾膜、飽和硫酸銨、樹脂層析進行一系列的純化獲得高純度的重組蛋白，為新型診斷試劑盒的研制提供基本資料。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒

pET-sVP2重組質粒為本實驗室構建；大腸桿菌表達載體pET-SUMO、宿主菌BL21均購自北京原平皓生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

限制性內切酶NcoI和HindⅢ購自南京生物制品有限公司；蛋白質分子質量標準購自南京生物制品有限公司；T4DNA連接酶購自Promega公司。質粒提取純化試劑盒購自Omega公司。DNA片段純化回收試劑盒購自Axygen公司。

1.3 重組蛋白的表達、可溶性分析

采用不同 IPTG 濃度（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L）、不同時間（0，1，2，3，4，5，6，7h）、不同溫度(25，27，29，31，33，35，37℃)對pET-sVP2重組蛋白進行誘導表達。經SDS-PAGE分析，確定重組蛋白的最佳條件誘導表達后，冰浴超聲裂解表達菌，于4℃離心機13000 r/min離心10min，收集上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳，鑒定其可溶性，為下一步蛋白的純化提供依據。

1.4 重組蛋白的純化

將經SDS-PAGE電泳鑒定后的以包涵體形式表達的重組蛋白洗滌后，于－80℃冰箱反復凍融3次后進行超聲裂解；離心，收集上清液，用0.45μm濾器過濾除去大分子雜質。收集濾液分段加入硫酸銨，4℃攪拌過夜析出沉淀，然后離心6min，沉淀重懸于PBS中，透析、除鹽。將經硫酸銨純化后的重組蛋白上Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱進行純化。用透析袋對純化后的蛋白進行復性，用紫外分光光度法測定蛋白濃度。

2 結果

2.1 表達產物的SDS-PAGE

經誘導表達的重組蛋白進行SDS-PAGE，可見一明顯52ku的目的條帶，與預期結果一致（見圖 1）。將重組菌體進行超聲破碎，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。結果顯示，重組蛋白在上清中含量較少，主要以包涵體的形式進行表達（見圖 1）。

圖1 重組蛋白的SDS-PAGE分析

2.2 表達產物純化后的SDS-PAGE

取純化的蛋白樣品沸水浴5min，取20μL進行SDS-PAGE，結果顯示經過濾膜、飽和硫酸銨純化后除掉了大量的雜蛋白，經過Ni-NTA柱純化后在52ku處僅有一清晰的特異性條帶（見圖2）。證明純化效果良好。紫外分光光度法測定蛋白濃度為2.29mg/mL。

圖2 重組蛋白的純化

3 討論

目前，國內外針對豬細小病毒病的診斷有很多方法，其中以全病毒為檢測抗原的免疫學方法較為常用,但由于全病毒在檢測應用過程中有很強的感染性，且其生產和純化技術要求較高。因此應用重組蛋白作為抗原來檢測豬細小病毒病顯得尤為重要[3-4]。在大腸桿菌表達系統中，pET系統是蛋白表達的首選。在IPTG存在的條件下，該系統可調動幾乎所有細胞資源都用于目的基因表達[5]。故本研究選擇大腸桿菌表達載體pET-SUMO，使得重組蛋白得以高效表達。常用的純化方法有中性鹽沉淀法、低溫乙醇沉淀法、凝膠柱層析法、免疫親和層析、高效液相色譜法等[6]。本研究通過對純化流程的優化，對融合蛋白進行純化并去除了雜蛋白，電泳結果可以看出，幾乎清除所有的雜蛋白而只保留了目的蛋白，試驗證明大大提高了融合蛋白的純度。旨在為豬細小病毒病診斷方法的建立提供大量高純度的重組VP2蛋白；同時，也為實現重組VP2蛋白的規模化生產提供參考數據。