綿羊胚胎附植過程中相關因素的研究

孔維歡 ，代 蓉 ，萬鵬程 ＊，石國慶 ＊

（1.石河子大學動物科技學院 832000；2.新疆農墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所 832000）

胚胎附植是指哺乳動物由受精卵開始卵裂分化至囊胚階段出現(xiàn)細胞定位，結束游離狀態(tài)，并開始與母體子宮建立初步聯(lián)系的一個過程，又稱胚胎著床。它是妊娠建立的關鍵步驟，也是胚胎早期發(fā)育的重要環(huán)節(jié)。然而早期胚胎的附植又與腫瘤侵襲過程有極大的相似性，在母體子宮內膜的細胞表面能夠發(fā)生定位、黏附、連接及侵入等[1]生理反應過程。一旦胚胎著床，胚泡及子宮內膜的形態(tài)結構就會隨著生理狀態(tài)的改變而發(fā)生變化。如：子宮內膜上皮細胞出現(xiàn)增殖分化，相鄰上皮細胞之間發(fā)生融合，以及滋養(yǎng)層細胞與子宮內膜之間的融合等均能使得胚胎與子宮壁結合，進而與母體進行營養(yǎng)物質及遺傳信息的交換與傳遞。這一點是保證了胚胎的正常發(fā)育、著床和妊娠。所以，胚胎的附植過程實質上就是胚胎與母體之間復雜而精細的多因子雙向免疫調控的結果[2]。

1 綿羊胚胎附植早期遷移生長的過程

由于胚胎滋養(yǎng)層侵襲程度的大小，胚胎在著床時分為侵入型著床和非侵入型著床2種方式，其中羊、牛等反芻動物為非侵入型著床（圖1）。但無論是反芻/非反芻型動物，所有哺乳型動物在完成胚胎附植的全過程都要經歷胚胎自身發(fā)育遷移、附植窗口的準備、母胎識別、胚胎定位與黏附等4個階段。

圖1 非侵入型胚胎附植的時期變化

我們以綿羊胚胎為例，它的附植過程也大致分為囊胚的孵化、自身的伸長、與子宮內膜細胞的附植預接觸，還有胚胎的定位與黏附等幾個階段。而囊胚的孵化就標志著胚胎與母體子宮的一種分子對話，開始密切的信號聯(lián)系。通常在妊娠第6d形成胚泡，第8d囊胚突破透明帶孵出，胚胎便吸取滋養(yǎng)層細胞的營養(yǎng)劇烈生長，發(fā)生形態(tài)學變化。妊娠第11d由球形變?yōu)楣苄危降?2d時長度可達10～22mm，到17d已達25cm以上[3]。其中妊娠的第14d，第1次出現(xiàn)雙核細胞，它是胚胎附植的典型標志之一。但其功能尚未完全清楚，可能與合成催乳素、類固醇激素、妊娠蛋白等物質有關（圖 2）。另外，在綿羊妊娠的第13d胚胎伸長的過程中滋養(yǎng)層細胞可形成指狀形突起，緊接著第14～15d定位并初步附著于子宮，并在第17d左右發(fā)生黏附附植，絨毛不斷生長至血管生成。同時合成分泌妊娠蛋白、類固醇激素等物質來調節(jié)母體生理內環(huán)境，至妊娠第21d附植基本完成。隨后至第30d胚胎滋養(yǎng)層絨毛與子宮阜的組織形成“母包子型”胎盤[4]，指狀突起也隨之消失。

圖2 綿羊胚胎附植遷移模式及與母體血漿激素水平

2 雌激素、孕激素與胚胎附植的關聯(lián)

雌激素的分泌主要源于卵巢的顆粒細胞、黃體及胎盤，在雌性動物各個生長發(fā)育階段都有一定的生理效應。在大多數(shù)哺乳動物正常發(fā)情期，雌激素濃度迅速升高，使得生殖道充血、輸卵管分泌活動增強、子宮管狀腺分泌增加，為促進卵泡發(fā)育、動物發(fā)情及子宮和陰道腺上皮增生平滑肌收縮等有利于動物交配、授精、妊娠等生理活動做準備[5]。但在反芻動物綿羊和牛中，還需孕激素的參與，如：生殖道受雌激素刺激發(fā)育后，只有經過孕酮（孕激素的一種活性物質，又稱黃體酮 progesterone）的作用，才能發(fā)育得更加充分。所以，雌激素和孕激素是雌性動物生殖系統(tǒng)生長發(fā)育重要的性腺激素，在維持繁殖機能方面有重要的作用。尤其在胚胎附植期，雌激素起著重要的主導作用，刺激并維持雌性動物生殖道的發(fā)育。在奶牛、湖羊[6]、海門山羊[7]、波爾山羊[8]等諸多實驗研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)情周期分泌量呈周期性變化的雌激素與孕酮又呈負相關[9]，即子宮內膜增殖期主要分泌雌激素，分泌期時為孕激素，而后發(fā)情后期孕激素的分泌量又逐漸降低。

然而在正常的雌性動物體內，孕酮和雌激素在生殖系統(tǒng)方面不僅有拮抗作用，又有協(xié)同的作用，即少量孕酮與雌激素能夠共同誘發(fā)動物發(fā)情行為。在動物體內，孕激素常以孕酮的生物活性最高，是雌雄激素生物合成的前體，屬于具有獨立生理功能的性腺類固醇激素。妊娠早期的子宮內膜功能主要是由卵巢分泌的孕酮及孕體分泌的IFN-t來調節(jié)[10]，其中孕酮在子宮內膜由增殖期到分泌期、子宮內膜基質細胞分化為蛻膜細胞及胚泡著床和早孕維持中有著重要的作用，也是胎盤形成必需的孕激素。諸如有研究顯示，牛在排卵后孕酮量的升高與胚胎發(fā)育呈正相關[11-13]及受精和體細胞核移植后增加孕酮的量會提高胚胎的存活率[14-15]，但補充孕酮對牛和綿羊的妊娠率是沒有任何影響的[16-17]。

綜上在每個發(fā)情周期，子宮內膜都會在雌激素的預先作用下，孕酮促使子宮內膜增厚，刺激子宮腺增長，彎曲增多，分泌功能加強，抑制子宮的自發(fā)性活動，降低子宮肌層的興奮作用（如對前列腺素和催產素的反應），從而保證胚胎的發(fā)育和著床，維持正常妊娠的狀態(tài)。同時促使子宮頸口和陰道收縮，子宮頸黏液變黏稠，防止異物侵入，利于保胎，即胚胎附植過程中子宮分化到使胚胎著床的狀態(tài)，就是雌激素與孕激素之間一種相互協(xié)調作用的結果。它們能夠共同作用于子宮內膜腺體合成并分泌多種細胞因子及蛋白營養(yǎng)物質和前列腺素，促使子宮內膜處于最佳容受狀態(tài)，為胚胎提供良好的附植環(huán)境[18]。

3 胚胎附植期分子免疫調控

胚胎著床的分子機制一直是生殖生物學領域的研究熱點，隨著人們對關鍵調控激素、調節(jié)因子以及信號通路等研究的不斷深入，各類蛋白酶、細胞因子等非激素類分子在胚胎著床中的作用已得到廣泛的關注。例如，胚胎著床期的子宮內膜處于經雌激素刺激后孕激素濃度較高的環(huán)境，這增強了趨化因子和細胞因子 LIF[19]、IL-1、IL-6[20]及 EGF[21]的表達，進而在胚胎附植過程中發(fā)揮重要的生物學作用，但是他們之間的一些調節(jié)機制并不是很清楚。

3.1 母-胎界面的免疫調節(jié)

從免疫學角度來講，妊娠等同于同種異體移植，它的建立與維持取決于胚胎附植發(fā)育過程中母體蛻膜局部或全身的一種系統(tǒng)免疫耐受狀態(tài)的變化，是一個相當復雜而又精確的過程[22]。母-胎界面免疫微環(huán)境中存在一種精妙的免疫平衡關系,一方面使得胎兒附植在宮內正常發(fā)育,另一方面適度活化抵抗病原體侵入，以防感染后蛻膜局部免疫系統(tǒng)發(fā)生改變而打破母胎間的免疫平衡,產生胎兒免疫排斥，引起胎兒早產、流產、畸形、生長發(fā)育受阻、子癇前期等妊娠病理疾病的發(fā)生。這種免疫平衡有賴于多種免疫細胞和細胞因子的參與及相互調節(jié)，對于維持正常妊娠起不可或缺的關鍵性作用。

例如，在維持正常妊娠上發(fā)揮著至關重要作用的子宮蛻膜基質細胞[23]就能夠通過分泌多種細胞因子來營養(yǎng)胚泡、內分泌以及調控滋養(yǎng)層細胞的侵入，從而防止發(fā)生胎兒免疫排斥，保護胎兒的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠這種母胎間復雜的免疫應答及免疫調節(jié)機制過程中Th1和Th2間的動態(tài)平衡顯得尤為重要。如：正常的妊娠可依賴Th2型細胞因子（IL-6等）的免疫反應，而Th1型免疫及其相關細胞因子（IL-1β等）卻能引起母胎界面炎性反應導致胎盤損壞、誘發(fā)流產，并且當Th2型細胞因子收到體外因素誘導下會向Th1型細胞因子轉換而影響妊娠[24]。

LPS是誘發(fā)炎癥反應的關鍵細胞毒性因子，對子宮內膜細胞有著雙重作用，即低濃度可促進內膜細胞增殖，高濃度抑制內膜細胞生長且呈濃度依賴性[25]，會隨著LPS劑量的增加加快細胞的凋亡。LPS還能夠誘導粒細胞、子宮內膜細胞等合成和分泌多種細胞因子，引發(fā)繁殖障礙。尤昭玲[26]、金婉冰[27]等檢測到流產或經LPS誘導的小鼠蛻膜中TNF-α、IFN-γ的濃度較正常妊娠小鼠中顯著升高，而IL-4、IL-10表達則明顯降低，說明炎癥反應期間胎界面免疫反應偏離了Th2，傾向于Th1而易造成流產的結果。付靈梅等[28]研究發(fā)現(xiàn)正常的子宮內膜細胞在受到LPS培養(yǎng)液誘導后，急性炎癥早期細胞因子TNF-α、IL-1β的分泌濃度隨著作用時間增長呈上升趨勢。所以，探究LPS引起子宮內膜細胞炎癥損傷導致著床障礙機制中LPS參與免疫因子的調控機制，能夠為治療胚胎附植障礙提供理論依據。

3.2 TLR4與胚胎附植

TLR4作為一類天天免疫受體蛋白，與LPS識別結合參與炎癥免疫反應，發(fā)生細胞的增殖與分化、遷移與凋亡及血管的生成有密切的關系。以前的研究顯示TLR4參與小鼠[29]和人[30]的胚胎著床過程，表達于圍著床期小鼠和人的蛻膜組織及蛻膜細胞，并且在小鼠的妊娠過程中LPS的誘導可調控TLR4基因及信號通路下游因子的表達，進而維持正常的妊娠，表明TLR4與胚胎附植有關。綿羊著床期間子宮內膜和胚胎的滋養(yǎng)層都發(fā)生胎滋養(yǎng)層細胞融合、子宮內膜上皮與滋養(yǎng)層的識別融合等，這些細胞形態(tài)的明顯變化需要細胞內各種信號因子的協(xié)調作用來調控。同時，這些研究提示TLR4受體可通過相同的機制參與不同物種的胚胎著床。

結語

綜上所述，反芻動物的胚胎著床和胎盤形成是一個復雜的生理過程，是妊娠建立的關鍵環(huán)節(jié)。目前可以說動物的胚胎移植、核移植克隆技術和轉基因技術的發(fā)展障礙在于胚胎著床率低、出生率低。所以，提高胚胎工程技術的關鍵就在于提高胚胎工程操作胚胎附植著床的能力和動物的出生率，這也就提高了技術效率，降低了技術成本，其中潛在的經濟意義自然就不言而喻了。因此，關于胚胎附植能力的研究、子宮發(fā)育到可接受胚胎狀態(tài)的研究及胚胎與母體子宮間相互作用的研究是提高家畜妊娠能力和動物繁殖力的關鍵。同時這樣的研究具有巨大的理論意義和潛在的經濟價值。