p38 MAPK在阿爾茨海默病患者中的表達及作用機制

任啟霞 崔 瓊 解承娟

(青海省第三人民醫院檢驗科，青海 西寧 810001)

阿爾茨海默病(AD)臨床主要表現為記憶力下降，言語、認知等功能受到損害〔1〕。目前AD的發生機制尚未明確，神經元丟失、老年斑產生及神經纖維的聚集可能是其發生的重要原因〔2〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一種廣泛表達于哺乳動物的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠通過三級級聯反應將外界信號傳遞到細胞核，調控靶基因轉錄，參與細胞生長、發育、分化、凋亡等過程〔3～5〕。p38 MAPK在外界刺激如滲透壓變化、紫外線、生理應激、缺氧、高糖、高脂等刺激下會促進細胞凋亡，被稱為應激MAPK信號通路〔6〕。已有研究表明，p38 MAPK在AD腦組織中被激活〔7〕，但在外周血中的表達尚未見報道，且p38 MAPK在AD的發生發展中的作用報道較少，本研究將進一步探討p38 MAPK在AD患者外周血淋巴細胞中的表達及相關機制。

1 材料與方法

1.1標本來源 根據美國國立神經病語言障礙腦卒中和阿爾茨海默病及相關疾病學會(NINCDS-ADRDA)AD的診斷標準，收集2015年3月至2017年3月青海省第三人民醫院進行診斷的82例AD患者，其中男32例，女50例，年齡67～82〔平均(68.9±1.56)〕歲，病程1.2～4.3年。患者均無自身免疫性疾病或內分泌性疾病，也無因腦血管、腦外傷等導致的血管癡呆，家族無精神病史。同時期在本院進行健康體檢的志愿者20例，男6例，女14例，年齡68～82〔平均(70.1±2.32)歲〕?；颊呋蚣覍僦橥?，并由我院倫理委員會通過。

1.2試劑與儀器 四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DMEM培養基均購自美國Hyclone公司；p38 MAPK抑制劑SB203580、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗人p38 MAPK，pp38 MAPK，B淋巴細胞瘤，Bcl-2，Bcl-2相關X蛋白(Bax)，p53，酶切天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體均購自美國Abcam公司；Caspase3活性檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司。MK3酶標儀購自美國thermo公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀，DYCZ-25D型轉印電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統購自美國伯樂公司。

1.3淋巴細胞的獲得 研究對象均于空腹前抽取10 ml靜脈血于抗凝管中，室溫靜置2 h后，加入等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，后以1∶2的比例緩慢將混合液加入淋巴細胞分離液中，1 500 r/min離心15 min，此時發現細胞分層，由上至下第2層即為淋巴細胞層，小心取此層細胞液，反復清洗離心2次，即可獲得外周血淋巴細胞，然后采用Western印跡檢測外周血中p38 MAPK的表達。

1.4分組 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫。PC12細胞隨機分為正常組、模型組和SB203580組，模型組及SB203580組采用20 μmol/L β淀粉樣蛋白(Aβ25～35)構建PC12細胞損傷模型。

1.5MTT法檢測細胞活力 將5×103個PC12細胞接種于96孔板，培養24 h，按1.4分組給藥，繼續培養48 h后，加入20 μl終濃度為5 mg/ml 的MTT孵育4 h，翻轉96孔板舍棄上清液，再加入150 μl的二甲基亞砜，震蕩使結晶物溶解，于酶標儀波長560 nm處測OD值，即代表細胞活力。

1.6Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡情況 將8×103個PC12細胞接種于6孔板，培養24 h，按1.4分組給藥，繼續培養48 h后，每組收集1×105/ml個細胞，加入500 μl結合緩沖液吹打混勻后，再按順序將5 μl Annexin V-FITC及5 μl PI加入，繼續吹打混勻，在室溫條件下避光孵育10 min，于1 h內在流式細胞儀上進行細胞凋亡分析。

1.7紫外分光光度法檢測Caspase3活性 將8×103個PC12細胞接種于6孔板，培養24 h，按1.4分組給藥，繼續培養48 h后，收集細胞，加入0.25%胰蛋白酶裂解細胞，收集細胞上清液，按照Caspase3活性檢測試劑盒檢測Caspase3活性。

1.8Western印跡檢測p38 MAPK、pp38 MAPK、Bax、Bcl-2、p53、酶切Caspase3蛋白表達 在冰浴條件下收集細胞，加入細胞裂解液裂解30 min，在4℃條件下離心，收獲上清液即總蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。制作5%濃縮膠，12%分離膠，室溫水封靜置30 min。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，濕法轉膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人p38 MAPK、pp38 MAPK、Bax、Bcl-2、p53、酶切Caspase3及GAPDH多克隆抗體，稀釋度為1∶100)孵育，4℃過夜；二抗溶液室溫孵育1 h。在凝膠成像系統中曝光。用Quantity one軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.9統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1p38 MAPK在AD患者外周血淋巴細胞中的表達及激活情況 AD患者外周血淋巴細胞中p38 MAPK表達量(1.04±0.12)與健康志愿者(0.98±0.11)差異無統計學意義(P>0.05)，而AD患者外周血淋巴細胞中pp38 MAPK表達量(1.12±0.12)顯著高于健康志愿者(0.34±0.03，P<0.01)。見圖1。

2.2SB203580對Aβ25～35誘導PC12細胞活力的影響 與正常組(0.68±0.07)比較，模型組細胞活力(0.38±0.04)降低，與模型組比較，SB203580組(0.59±0.06)顯著提高(均P<0.01)。見圖2。

2.3SB203580對Aβ25～35誘導PC12細胞凋亡的影響 與正常組(3.18%±0.31%、2.56%±0.25%)比較，模型組細胞早期凋亡率(21.49%±2.15%)及晚期凋亡率(18.32%±1.83%)均顯著提高，與模型組比較，SB203580組(7.55%±0.75%、3.24%±0.32%)均顯著降低(P<0.01)。

2.4SB203580對Aβ25～35誘導PC12細胞中Bcl-2及Bax表達的影響 與正常組Bcl-2(0.42±0.04)、Bax(0.20±0.02)比較，模型組中Bcl-2表達(0.15±0.10)下調，Bax表達(0.48±0.05)上調(均P<0.01)，與模型組比較，SB203580組中Bcl-2表達(0.32±0.03)上調，Bax表達(0.26±0.03)下調(均P<0.01)。見圖2。

2.5SB203580對Aβ25～35誘導PC12細胞中p53及酶切Caspase3表達的影響 與正常組p53(0.13±0.01)、酶切Caspase3(0.16±0.01)比較，模型組中p53(0.42±0.04)及酶切Caspase3(2.19±0.22)表達上調(P<0.01)，與模型組比較，SB203580組(0.17±0.02,0.18±0.02)均表達下調(P<0.01)。見圖3。

2.6SB203580對Aβ25～35誘導PC12細胞中Caspase3活性的影響 與正常組Caspase3活性〔(0.56±0.05)μg/ml〕比較，模型組〔(4.38±0.43)μg/ml〕顯著提高，與模型組比較，SB203580組〔(1.12±0.11)μg/ml〕顯著降低(均P<0.01)。

圖2 SB203580對Aβ25～35誘導PC12細胞中Bcl-2及Bax表達的影響

圖3 SB203580對Aβ25～35誘導PC12細胞中p53及酶切Caspase3表達的影響

3 討 論

本研究提示p38 MAPK對AD的發生發展可能起著促進作用。神經元及突觸的丟失、神經纖維的聚集及老年斑的產生是AD的主要病理特征〔2〕。Aβ沉積是老年斑形成的主要原因，是AD發生及發展的重要因素〔2〕。Aβ包括Aβ1～40、Aβ1～42、Aβ25～35 3個片段，其中Aβ25～35不僅能夠促進老年斑形成，還對神經元具有毒性作用，是模擬AD模型的主要片段之一，是目前AD治療的主要靶點之一〔8〕。另外SB203580是p38 MAPK特異性抑制劑，是探討p38 MAPK信號通路阻斷后細胞后續應答反應的常用抑制劑〔6〕。因此本研究參考相關文獻并預實驗〔8〕，結果提示阻斷p38 MAPK信號通路能夠抑制Aβ25～35誘導的PC12細胞凋亡。

Bcl-2是研究最為廣泛的抑制凋亡蛋白，能夠與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號的傳遞，而且還能夠抑制p53介導的細胞凋亡，從而促進細胞存活及生長。Bax能夠自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞給Caspase家族，促使級聯放大，誘導細胞凋亡。Caspase3是Caspase家族下游蛋白，正常生理條件下，以無活性蛋白形式存在，在凋亡因素的刺激下，Caspase3被激活并被切割成酶切Caspase3，導致DNA斷裂，細胞形態發生變化，最終誘導細胞凋亡。同時有研究報道通過下調pp38 MAPK表達，進而上調Bcl-2表達，抑制酶切Caspase3表達，能夠顯著的治療膽固醇誘導的大鼠動脈粥樣硬化〔9〕。降低p38 MAPK磷酸化水平，進而提高Bcl-2表達及Bcl-2/Bax比例，能夠顯著抑制放射誘導的H9c2心肌細胞損傷〔10〕。本研究結果表明SB203580能顯著上調Bcl-2表達，下調Bax、p53及酶切Caspase3表達，降低Caspase3活性，最終抑制Aβ25～35誘導的PC12細胞凋亡。

1郭 敏，李樹民，張 弘，等.阿爾茲海默病的表觀遺傳學機制研究進展〔J〕.中國臨床藥理學雜志，2014；30(3)：232-4.

2孫禹堯.阿爾茨海默病中Aβ聚集的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(12)：2991-2.

3Reig I，Boixeda P，Fleta B，etal.Neurofibromatosis-noonan syndrome：case report and clinicopathogenic review of the Neurofibromatosis-Noonan syndrome and RAS-MAPK pathway〔J〕.Dermatol Online J，2011；17(4)：4.

4張美榮，劉 舉，王 洋.絲裂原激活蛋白激酶相關疾病及其藥物的研究進展〔J〕.中國藥物化學雜志，2014；24(3)：231-40.

5劉婷婷，張淑萍，覃筱燕，等.MAPK信號轉導通路與神經損傷研究進展〔J〕.中國公共衛生，2016；32(2)：248-54.

6肖 云，方 浩.小分子p38 MAPK抑制劑的研究進展〔J〕.中國藥物化學雜志，2015；25(4)：306-12.

7Sun A，Liu M，Nguyen XV，etal.P38 MAP kinase is activated at early stages in Alzheimer′s disease brain〔J〕.Exp Neurol，2003；183(2)：394-405.

8申茉函，王全才，楊 麗.β淀粉樣蛋白1～42促進神經細胞凋亡〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(13)：3498-501.

9Bayatmakoo R，Rashtchizadeh N，Yaghmaei P，etal.Atorvastatin inhibits cholesterol-induced caspase-3 cleavage through down-regulation of p38 and up-regulation of Bcl-2 in the rat carotid artery〔J〕.Cardiovasc J Afr，2017；28：1-6.

10Zhang W，Li Y，Li R，etal.Sodium tanshinone IIA sulfonate prevents radiation-induced toxicity in H9c2 cardiomyocytes〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med，2017；2017：4537974.