參附注射液對膿毒癥老齡大鼠腎臟組織炎癥因子表達的影響

馮 敏 劉 剛 徐大千

(鄭州大學第一附屬醫院重癥醫學科，河南 鄭州 450052)

膿毒癥是一種具有全身性的炎癥反應綜合征，起病急，發展迅速，致死率高，常并發于嚴重創傷、燒傷、感染及大手術等多種應激狀況，可誘發多器官病變，成為目前臨床急危重癥患者主要的死亡原因之一。約有17%的膿毒癥病人會并發急性腎衰竭，損害中樞神經系統，發生電解質紊亂，導致尿毒癥性肺部炎癥，最終引起呼吸衰竭、死亡〔1,2〕。膿毒癥的突出特征是炎癥反應與抗炎反應失控。白細胞介素(IL)-6、CD14、IL-18在膿毒癥發病機制中起關鍵作用，參與免疫和炎性反應的調控，可誘導急性期蛋白的合成，誘導炎癥反應〔3～10〕。目前有關參附注射液對膿毒癥方面的研究報道較少。本實驗研究參附注射液對膿毒癥大鼠腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑 烏司他丁注射液，廣東天普生化醫藥股份有限公司，批號：國藥準字H20040506。尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及谷氨酸氨基轉移酶(ALT)生化試劑(德國Prodia公司)，IL-6、CD14、IL-18試劑盒(美國Biosource公司),β2-免疫分析盒(北方生物技術研究所)，參附注射液(每毫升相當于生藥：紅參0.1 g，附片0.2 g，雅安三九藥業有限公司)。

1.1.2動物 健康雄性SD大鼠136只，購于廣東藥學院實驗動物中心，SPF級，體質量(350±20)g，許可證號SCXK(粵)2015-0022。本實驗操作過程中及實驗結束后，對各大鼠的處理方法均符合2006年中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2方法

1.2.1膿毒癥大鼠模型制備與分組 膿毒癥大鼠模型的制備方法參照文獻〔11～14〕：造模前SD大鼠禁食12 h，以7.5 mg/100 g鹽酸氯胺酮和2.0 mg/100 g賽拉嗪腹腔注射進行麻醉，固定于無菌操作臺上，用碘酊進行常規消毒，沿中下腹正中線進行1.5 cm切口，在大鼠盲腸中部進行結扎，用16號針貫穿盲腸一次(為防止針孔閉合，留一條橡皮片貫通盲腸)，將盲腸還納腹腔，縫合切口。術后立即注射5 ml 0.9%生理鹽水，放回鼠籠，自由飲食。

分為正常組(不作任何處理，n=8)，假手術組(不結扎不穿孔，只于相同部位進行切口及盲腸提出后再放回,n=8)，模型組(膿毒癥大鼠，n=40)，參附注射液中劑量組(膿毒癥大鼠，n=40)，參附注射液低、高劑量組(膿毒癥大鼠，n=8)，陽性藥組(膿毒癥大鼠，n=40)；前2組勻于尾靜脈注射等量生理鹽水，模型組于術后0、12、24、36、48 h經尾靜脈注射等量生理鹽水，參附注射液中劑量組于相同時間點經大鼠尾靜脈注射參附注射液，每次劑量4 ml/kg(參考臨床劑量)，低劑量組每次注射劑量為2 ml/kg，高劑量組每次注射劑量為6 ml/kg，陽性藥組于相同時間點經大鼠尾靜脈以100 000 U/kg注射烏司他丁注射液；模型組與參附注射液組分別于各時間隨機取8只，采集標本。

1.2.2標本的采集與處理 SD大鼠麻醉、消毒后，無菌條件下開腹，剝離暴露出腹主動脈，采集腹主動脈血約5 ml，置于離心試管中，3 000 r/min低溫高速離心10 min，取上層清液，于-80℃冰箱中保存，用于血清生化指標的測定；同樣無菌操作下摘取腎組織，于-80℃冰箱中保存，用于組織形態學觀察；用2 ml注射器從膀胱采集尿液，于-80℃冰箱中保存。

1.2.3血清及尿液中生化指標的測定 利用自動生化分析儀測定血清中Cr、BUN、ALT、K+及尿液中N-乙酰β-D-葡萄糖苷酶(NAG)、Na+含量，計算尿鈉排泄分數(FENa)。

1.2.4血清中IL-6及腎組織中IL-6、CD14、IL-18蛋白含量檢測 將腎組織從-80℃冰箱中取出，稱重后置于EP管中，加入15倍生理鹽水，用勻漿器勻漿，以1 400 r/min低溫離心15 min，吸取上清液；從冰箱中取出血清，于室溫融化，采用Bio-rad蛋白檢測試劑盒測定提取蛋白，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測腎組織和血清中的IL-6、CD14、IL-18蛋白含量。

1.3統計學分析 采用SPSS16.0統計，計量資料進行t檢驗、方差分析及相關回歸分析。

2 結 果

2.1各組腎功能指標比較 與正常組相比，模型組從12 h開始血清中BUN明顯升高(P<0.01)，雖然36 h呈現明顯降低，但到48 h又再次顯著升高(P<0.01)；同樣，與正常組比較，36 h和48 h模型組血清ALT顯著增加(P<0.05)；相較于血清中的BUN及ALT，大鼠血清中Cr含量增加緩慢，在48 h才表現出明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，膿毒癥大鼠經各劑量參附注射液治療12 h和48 h后，血清中BUN顯著降低(P<0.05)，治療36 h和48 h后血清中ALT顯著降低(P<0.05)，而Cr雖也有所降低，但降低緩慢，于48 h后才明顯降低(P<0.05)；與陽性藥組比較，參附注射液各劑量治療后效果明顯優于陽性藥組。給藥48 h，參附注射液低劑量組治療效果最差，與中、高劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，說明有一定的劑量依賴性，而中、高劑量組間相比差異無統計學意義(P>0.05)，說明達到一定劑量后對治療并沒有表現出明顯的效果。與正常組相比，48 h后模型組血清中的K+含量明顯增加(P<0.05)；12 h后模型組血清β2微球蛋白明顯升高(P<0.01)，但48 h后顯著降低(P<0.01)。尿液指標檢測顯示，與正常組相比，12～36 h模型組的FENa均呈現降低(P<0.01)；而同時間點模型大鼠尿NAG含量差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組相比，參附注射液各劑量組治療12 h后大鼠血清β2微球蛋白降低(P<0.01)，而治療組12～48 h FENa及NAG含量并沒有明顯變化；與陽性藥組比較差異無統計學意義(P>0.05)。不同給藥劑量數據結果分析，給藥48 h，參附注射液低劑量組治療效果與中、高劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，說明有一定的劑量依賴性，而中、高劑量組間相比差異無統計學意義(P>0.05)，說明達到一定劑量后對治療并沒有表現出明顯的效果。見圖1，圖2。

圖1 各組大鼠腎功能血清指標檢測結果

2.2各組IL-6蛋白水平比較 正常組與假手術組大鼠血清中均含有少量IL-6，組間差異無統計學意義(P>0.05)。造模成功后12 h，與正常組相比，模型大鼠血清中IL-6蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)，24 h達到最高(P<0.01)，而至36 h血清中IL-6蛋白表達水平下降顯著，接近于正常組，但48 h又明顯升高(P<0.01)；模型組腎臟組織中IL-6蛋白表達水平從12～36 h有緩慢升高表現，與正常組差異有統計學意義(P<0.01)，而至48 h又下降至與正常組持平水平。與模型組相比，參附注射液治療后，各劑量組12～48 h大鼠血清中IL-6蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，12 h腎臟組織中IL-6水平卻無顯著變化，而24～36 h腎臟組織中IL-6蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；膿毒癥大鼠經參附注射液治療后，效果明顯優于陽性藥組。參附注射液具有一定的劑量依賴性，且中、高劑量組間相比差異無統計學意義(P>0.05)，說明達到一定劑量后對治療并沒有表現出明顯的效果。見圖3。

2.3各組腎臟組織中CD14、IL-18蛋白相對含量比較 模型組腎臟組織中CD14蛋白表達水平最高，而陽性組與參附注射液各劑量組腎臟組織中CD14蛋白表達水平與模型組相比明顯降低(P<0.01)。與對照組相比，模型組IL-18蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，參附注射液高、中、低組腎臟組織中IL-18蛋白表達水平明顯減少(P<0.01)。見圖4。

圖2 各組大鼠腎功能尿液指標檢測結果

圖3 各組大鼠IL-6蛋白水平的檢測結果

圖4 大鼠腎臟組織中CD14、IL-18蛋白相對含量

3 討 論

炎癥反應是引起多器官功能障礙的主要因素，炎細胞的持續活化與播散導致炎癥介質過多產生與釋放，引起細胞乃至臟器損傷，嚴重者導致多臟器衰竭。研究顯示，通過激活炎癥因子可導致核轉錄因子(NF)-κB活化入核，引起IL-6，IL-18等炎癥因子的合成與釋放。參附注射液由紅參、附子組成，人參皂苷和烏頭堿為主要活性成分，具有溫陽益氣養心、回陽救逆的藥效。研究顯示，參附注射液對膿毒癥患者或動物具有一定的改善及保護作用，調節膿毒癥免疫紊亂及維持機體炎癥平衡〔15,16〕。膿毒癥可引起多種器官損傷，腎臟損傷是其常引起的并發癥，本研究結果顯示，參附注射液對膿毒癥炎癥大鼠腎臟具有明顯的保護作用，其通過抑制血清與腎組織中的IL-6、CD14、IL-18蛋白表達水平，抑制炎癥因子的釋放，實現參附注射液對膿毒癥大鼠的腎臟保護作用。

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