山楂葉總黃酮對慢性腦缺血大鼠p38MAPK信號通路的影響

吳曉光 白江濤 苗光新 李蒙蒙 苗 惠

(承德醫學院基礎醫學研究所 河北省中醫藥抗癡呆重點研究室，河北 承德 067000)

研究表明缺血性腦卒中損傷機制的關鍵與腦缺血缺氧后細胞正常的穩態環境受到破壞，某些信號轉導系統發生紊亂，神經細胞死亡密切相關〔1〕。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中成員的一個亞型，其激活后通過鏈式級聯反應，激活轉錄因子如活化轉錄因子(ArF)-2等，促進炎癥因子，凋亡基因的表達，在中樞神經系統疾病中發揮重要作用〔2〕。山楂葉總黃酮(TFHL)具有抗氧化〔3〕，減輕炎癥反應〔4〕，調控PI3K/Akt信號通路〔5〕等腦保護作用，但對p38MAPK信號通路的影響未見報道。本研究以慢性腦缺血模型大鼠為研究對象，以TFHL為干預手段，觀察其對模型大鼠學習記憶功能及腦組織p38MAPK蛋白表達的影響，探討TFHL對缺血性腦損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1動物與分組 清潔級SD大鼠，48只，體質量230～250 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司〔動物合格證：scxk(京)2014-0004〕。適應飼養1 w后大鼠隨機分為假手術組、慢性腦缺血模型組、TFHL組，銀杏葉片組，每組12只。

1.2藥物與試劑 TFHL由承德復康藥業有限公司，純度58%，用0.5%碳酸氫鈉溶液稀釋成濃度為140 mg/ml；銀杏葉片(揚子江藥業有限公司提供)；p38單克隆抗體(武漢博士德生物技術有限公司提供)。

1.3動物模型制備及給藥 模型組、TFHL組、銀杏葉片組的大鼠，采用雙側頸總動脈永久性結扎法〔5〕建立慢性腦缺血模型：3.5%水合氯醛麻醉，頸部正中切口，無創傷鑷子鈍性分離皮下組織及下頜下腺，玻璃分針小心分離雙側的頸總動脈，雙線結扎并用電刀切斷頸總動脈防止復流，碘伏消毒后，縫合切口，每只腹腔注射10萬U青霉素，預防感染。術后24 h內未蘇醒者剔除，并及時補遺。假手術組僅用玻璃分針游離出雙側頸總動脈，不做結扎處理。術后第30天開始，TFHL組給予TFHL 140 mg·kg-1·d-1灌胃，銀杏葉片組給予銀杏葉提取物6.5 mg·kg-1·d-1灌胃，連續30 d。假手術組給予等量生理鹽水灌胃。

1.4觀察指標及方法

1.4.1Morris水迷宮實驗 定位航行實驗:在TFHL給藥第30天，將大鼠依次放入Morris水迷宮進行適應性游泳訓練1次，共計60 s，不放平臺，不記錄成績行。給藥第31天，將平臺放入任一象限中，進行定位航行實驗，用于檢測大鼠對空間記憶的獲得能力：將大鼠從A、B、C、D 4個入水點面向池壁依次放入水中，觀察在60 s內大鼠找到并爬上平臺所用的時間(逃避潛伏期)。若60 s內未能找到平臺，則將其引導到平臺并在平臺上停留15 s，潛伏期記為60 s，每天1次，共6 d。空間探索實驗：用于檢測大鼠對平臺區域的準確記憶能力：第6天，定位航行實驗結束后，撤去平臺，由第2象限入水點面向池壁放入大鼠，觀察大鼠在60 s穿越平臺區域的次數及平臺象限游泳路程百分比。

1.4.2Western印跡法檢測p38MAPK蛋白的表達 末次給藥后1 h，斷頭取海馬組織，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈血液，加入裂解液和10 μl PMSF(10 mg/ml)，4℃勻漿，10 000 r/min，離心30 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。再經過SDS-PAGE電泳、轉膜、10% 脫脂奶粉封閉，加p38一抗(1∶150)4℃過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶1 000)室溫孵育2.5 h，超敏電化學發光液發光，X線片暗盒內曝光，D72顯影液顯影，利用Quantity One軟件分析X線膠片的灰度值。

1.5統計學方法 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1TFHL對各組定位航行能力的影響 與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期和尋找平臺游泳路程明顯延長；TFHL和銀杏葉片藥物干預后，大鼠逃避潛伏期和尋找平臺游泳路程明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，銀杏葉片組優于TFHL組，但兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2TFHL對大鼠空間探索能力的影響 與假手術組比較，模型組在60 s內穿越平臺區次數明顯減少，平臺象限游泳路程百分比明顯降低(均P<0.01)；TFHL和銀杏葉片藥物干預后，大鼠穿越平臺區次數分別增多，平臺象限游泳路程百分比明顯增加(P<0.05，P<0.01)，銀杏葉片組優于TFHL組，但兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3TFHL對大鼠p38MAPK蛋白表達的影響 與假手術組(0.007 9±0.002 1)比較，模型組p38MAPK蛋白表達顯著升高(0.025 4±0.001 83，P<0.01)；與模型組比較，TFHL組和銀杏葉片組p38MAPK蛋白表達明顯降低(0.016 1±0.003 2，0.015 7±0.000 24，P<0.01)；銀杏葉片組優于TFHL組，但兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

表1 各組定位航行能力比較

與假手術組比較:1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

表2 各組空間探索能力比較

1～4：假手術組、模型組、TFHL組和銀杏葉片組圖1 各組腦組織p38MAPK蛋白表達的變化

3 討 論

慢性腦缺血是神經系統一種常見的病理生理狀態，由長期腦灌注不足引起，可出現能量代謝障礙氧化應激-神經遞質改變-神經元缺失等變化，同時伴有大量膠質細胞增生，是阿爾茨海默病和血管性癡呆等許多與年齡相關性疾病的共同的病理生理過程〔6〕。慢性腦缺血導致的血管性癡呆以持久性或進展性認知功能障礙為主要特點，表現為學習記憶能力下降，對其發病機制及藥物干預的研究具有重要的臨床意義〔7,8〕。腦缺血激活了級聯反應，導致缺血半暗帶逐漸消失，壞死的腦組織區域增大，如何在腦部缺血性損傷后采取積極有效的治療措施搶救缺血半暗帶并減少腦組織的死亡區域，是提高腦梗死后患者生命質量的關鍵。

慢性持續性腦血流量降低可導致神經元不斷的凋亡，引起進行性的認知功能障礙，最終導致血管性癡呆的發病。凋亡是多基因控制的程序性細胞死亡過程。MAPK屬于絲氨酸芳氨酸蛋白激酶家族，存在于大多數細胞內，是真核細胞細胞外信號轉導到細胞內引起細胞反應的一類重要信號通路，在缺血性腦損傷中起著調節細胞存活和分化的作用〔9〕。p38MAPK是MAPKs家族重要成員之一，其活化后介導的信號轉導通路是細胞對周圍環境變化的應激反應，調節細胞的分化、發育、存活及死亡多種重要的細胞生理/病理過程。腦缺血時，p38MAPK被激活，其表達水平及上游和下游蛋白磷酸化水平均發生改變，介導了腦缺血后神經細胞的凋亡〔10,11〕。有研究表明，側腦室或舌下靜脈注射p38MAPK抑制劑SB 203580可減輕腦組織缺血引起的神經元凋亡〔12〕，縮小腦損傷的體積，改善神經功能的缺陷〔9〕。本研究結果提示TFHL具有抑制腦缺血誘發的p38MAPK過度表達的作用，同時大鼠學習記憶能力顯著提高與對p38MAPK信號途徑的調控有關。

1趙雅寧，劉 樂，安朝旺，等.補陽還五湯通過抑制p38有絲分裂原激活蛋白激酶通路改善大鼠缺血性腦損傷〔J〕.解剖學雜志，2011;34(1)：48-51.

2李國輝，王耀輝.p38信號通路與缺血性腦卒中〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2014;16(7)：779-80.

3吳曉光，李 玲，苗光新，等.山楂葉總黃酮對血管性癡呆大鼠學習記憶的干預作用及機制〔J〕.中國老年學雜志，2015;35(14):3819-22.

4檀榮芳，夏愛華，吳曉光，等.山楂葉總黃酮抑制慢性腦缺血大鼠腦組織神經元凋亡〔J〕.中國組織工程研究,2014;18(49):7879-83.

5趙 蕾，張曉紅，吳柏成，等.山楂葉總黃酮對腦缺血大鼠腦組織 PI3K/Akt信號通路的影響〔J〕.廣東醫學，2014;35(7):982-4.

6牟靜靜，孟 星，孟盼盼，等.腦脈泰對慢性腦缺血大鼠認知功能的保護作用及其機制研究〔J〕.中風與神經疾病雜志，2015;32(1)：21-4.

7余 芬，張軍建.慢性腦缺血大鼠海馬中APE的表達與神經凋亡的實驗研究〔J〕.中華神經醫學雜志，2006;5(4):363-6.

8王曉天，劉曉梅，尤紅娟，等.p38MAPK介導的Fas/FasL凋亡通路在缺血性腦損傷中的作用研究〔J〕.中國醫藥指南，2014;12(31)：1-2.

9祝萍萍,徐 恩.p38MAPK信號轉導通路與腦缺血〔J〕.國際腦血管病雜志，2011;19(11)：853-6.

10Roychoudhury G，Ryou MG，Poteet E,etal.Involvement of p38MAPK in reactive astroghosis induced by schemlc stroke〔J〕.Brain Res，2014;1551：45-58.

11李 浩，張多斌，吳 嵐，等.丹參酮ⅡA對腦缺血再灌注損傷大鼠磷酸化p38MAPK和MMP-9表達及細胞凋亡的影響〔J〕.中風與神經疾病雜志，2013;30(30):229-33.

12Nito C，Kamada H，Endo H，etal.Role of the p38 mitogenactivated profein kinase/cytosolic phospholipase A2 signaling pathwayin blood brain barrierd isruption after focal cerebral ischemia and reperfusion〔J〕.J Cereb Blood How Metab，2008;28(10)：1686-96.