淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松性老年骨折模型愈合過(guò)程的影響

鄧 君 邱 波

(湖北第三人民醫(yī)院急診科，湖北 武漢 430000)

骨質(zhì)疏松是一種與衰老密切相關(guān)的病理現(xiàn)象，臨床以骨量減少、骨組織結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨的脆性增高，增加骨折風(fēng)險(xiǎn)。骨質(zhì)疏松性骨折是骨強(qiáng)度下降導(dǎo)致的骨折，是骨質(zhì)疏松最嚴(yán)重的后果。據(jù)統(tǒng)計(jì)，55%骨質(zhì)疏松發(fā)生于老年人，其中約10%會(huì)發(fā)生骨折，嚴(yán)重威脅老年人身心健康和影響生活質(zhì)量〔1～3〕。淫羊藿具有補(bǔ)益腎陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨等功效，常用于骨質(zhì)疏松、骨折后期等疾病〔4,5〕。淫羊藿苷是淫羊藿最重要的有效成分，對(duì)體內(nèi)外的成骨細(xì)胞均能有效進(jìn)行干預(yù)，并對(duì)骨間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)、分化、凋亡有多層次的影響〔6～8〕。本文旨在探討淫羊藿苷對(duì)骨質(zhì)疏松性老年骨折愈合過(guò)程的影響。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物與藥物 15月齡，體質(zhì)量(530±20)g，SPF級(jí)SD大鼠90只，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0064〕。淫羊藿苷(廣州谷多生物科技有限公司)，溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液，低溫、避光保存。

1.2主要試劑與儀器 注射用青霉素鈉(400萬(wàn)U/支，中諾藥業(yè)有限公司)；骨保護(hù)素(OPG)，免疫組化檢測(cè)試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒、鈣測(cè)定試劑盒、磷測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；蘇木素-伊紅、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(天津市申泰化學(xué)試劑有限公司)；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(日本)；NORLAND EXCELL雙能X線吸收儀(美國(guó)NORLAND公司)；紫外光柵分光光度計(jì)752型(山東高密彩虹分析儀器有限公司)。

1.3方法

1.3.1骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型制備 造模大鼠用維A酸以80 mg/kg進(jìn)行灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃3 w，建立骨質(zhì)疏松模型；第4周時(shí)對(duì)大鼠進(jìn)行骨密度檢測(cè)，驗(yàn)證造模成功。所有造模大鼠35 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉，固定在手術(shù)板上，碘伏消毒，右后腿中段前外側(cè)切口，人工造成右側(cè)脛骨中上段骨折，將1 mm克氏針從脛骨近端至遠(yuǎn)端髓內(nèi)固定，縫合傷口，造成骨質(zhì)疏松性骨折模型，術(shù)后每日注射10萬(wàn)U青霉素鈉，連續(xù)3 d。同時(shí)取30只SD大鼠，灌胃等量蒸餾水，同樣方法只有手術(shù)切口，不損傷脛骨，縫合傷口，作為假手術(shù)組。

1.3.2分組及給藥處理 手術(shù)后正常飼養(yǎng)，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組。30只/組。實(shí)驗(yàn)組大鼠給予腹腔注射淫羊藿苷100 μg/kg；假手術(shù)組、模型組給予同體積0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，1次/d，連續(xù)注射10 d。

1.3.3觀察指標(biāo) 分別在術(shù)后第2、4、8、12周，各組隨機(jī)處死5只大鼠，取骨折處為中點(diǎn)長(zhǎng)約1 cm股骨，收集標(biāo)本，4%多聚甲醛固定，20%乙二胺乙酸(EDTA)脫鈣，石蠟包埋，切片。切片組織學(xué)觀察，分別進(jìn)行HE染色和OPG免疫組織化學(xué)染色，采用圖像分析儀計(jì)算OPG蛋白陽(yáng)性表達(dá)積分光密度值(IOD)。在2、4、8、12 w對(duì)大鼠進(jìn)行X線吸收儀掃描，以骨折端為中心測(cè)量骨痂骨密度，并對(duì)左下肢進(jìn)行股骨骨密度檢測(cè)。術(shù)后2、4、8、12 w，分別于處死前行心臟取血5 ml，常溫靜置2 h，低溫條件下3 000 r/min離心10 min，收集血清，測(cè)定血清鈣磷乘積及ALP。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1組織學(xué)HE染色結(jié)果 術(shù)后2 w，肉芽組織機(jī)化，出現(xiàn)軟骨島；與實(shí)驗(yàn)組相比，模型組軟骨細(xì)胞數(shù)量、軟骨島面積較少。4 w時(shí)，模型組新生軟骨大量增多，未見(jiàn)網(wǎng)織骨形成；而實(shí)驗(yàn)組除有新生骨增多，并有網(wǎng)織骨形成。術(shù)后第8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組仍有肥大的軟骨細(xì)胞，開(kāi)始形成大量骨小梁，間隙間可見(jiàn)毛細(xì)血管；而模型組有大量肥大的軟骨細(xì)胞，且骨小梁少而細(xì)。術(shù)后12 w，實(shí)驗(yàn)組形成大量骨小梁，可見(jiàn)肥大的軟骨細(xì)胞；而模型組骨小梁較少。假手術(shù)組骨骼正常。見(jiàn)圖1。

圖1 模型組、實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)期HE染色結(jié)果(×100)

2.2OPG免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 術(shù)后2 w，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)骨膜內(nèi)增生細(xì)胞增多，成骨細(xì)胞、肉芽組織中的成纖維樣細(xì)胞及新生軟骨細(xì)胞陽(yáng)性廣泛表達(dá)；而模型組陽(yáng)性細(xì)胞著色淺，且表達(dá)數(shù)量明顯較少。術(shù)后第4周，實(shí)驗(yàn)組上述細(xì)胞陽(yáng)性持續(xù)表達(dá)，骨痂周?chē)某晒羌?xì)胞數(shù)量明顯高于模型組。術(shù)后第8周，實(shí)驗(yàn)組骨組織中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與陽(yáng)性程度與前幾周比有所下降，但軟骨細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)仍高于模型組。術(shù)后第12周，實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞著色呈陰性，多數(shù)肥大，陽(yáng)性著色者為成骨細(xì)胞和周?chē)念?lèi)骨質(zhì)，而模型組的表達(dá)類(lèi)似，但多數(shù)為軟骨細(xì)胞，著色較淺。術(shù)后2、4、8、12 w，模型組OPG免疫組化圖像IOD值分別為(155.04±2.62)、(124.25±7.48)、(133.58±4.22)、(84.67±4.20)，實(shí)驗(yàn)組分別(210.01±6.29)、(215.73±9.42)、(210.83±10.12)、(115.94±9.48)；在相同的時(shí)間段，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組IOD值明顯較高(P<0.05)。

2.3不同時(shí)間大鼠骨密度測(cè)定結(jié)果 在相同的時(shí)間段，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組骨痂骨密度明顯較高(P<0.05)；而左側(cè)股骨骨密度兩組在相同時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，模型組和實(shí)驗(yàn)組左側(cè)股骨骨密度均降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4大鼠血清鈣磷乘積及ALP檢測(cè)結(jié)果 在相同的時(shí)間段，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清鈣磷乘積略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組ALP水平明顯高于模型組及假手術(shù)組(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖2 模型組不同時(shí)期OPG免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×100)

表1 不同時(shí)間段各組骨密度測(cè)定結(jié)果

與假手術(shù)組相比：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

表2 不同時(shí)間段各組血清鈣磷乘積及ALP檢測(cè)結(jié)果

與實(shí)驗(yàn)組比較：1)P<0.05

3 討 論

骨質(zhì)疏松臨床治療主要采用雌激素類(lèi)、降鈣素和鈣制劑等，但副作用較大。骨質(zhì)疏松性骨折屬于中醫(yī)中的“骨痿、骨疲”，與中醫(yī)的“腎”有非常密切的關(guān)系。中醫(yī)對(duì)骨折的治療和促進(jìn)骨折愈合方面有豐富的經(jīng)驗(yàn)，其中以補(bǔ)腎理念為重要指導(dǎo)思想。淫羊藿小檗科植物，主在藥用成分為淫羊藿苷，藥理研究證實(shí)，淫羊藿能加速刺激骨髓細(xì)胞DNA的合成，刺激成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)增殖具有一定的促進(jìn)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，淫羊藿提取液對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用有影響，且隨劑量增加促進(jìn)作用越強(qiáng)〔9,10〕。有研究報(bào)道〔11～13〕，淫羊藿苷具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化、抑制成脂分化的功能，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化。骨折修復(fù)的核心是成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞前體的聚積、增殖和分化，OPG為骨代謝過(guò)程中骨再生的指標(biāo)。研究顯示，OPG具有抑制破骨細(xì)胞形成、分化、存活的功能，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組軟骨生成及軟骨內(nèi)成骨過(guò)程較模型組明顯較快，而且在各個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組蛋白陽(yáng)性表達(dá)的IOD值均較高，說(shuō)明淫羊藿苷增加了軟骨細(xì)胞的分化、增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞和成熟軟骨細(xì)胞OPG的表達(dá)，使骨形成加快，骨小梁形成增多，從而促進(jìn)愈合。

ALP主要來(lái)源于骨組織，主要促進(jìn)磷酸鈣的生成而沉淀于骨組織內(nèi)，而血液中鈣磷含量又直接影響骨的鈣化與溶解。本研究通過(guò)檢測(cè)ALP及鈣磷乘積水平發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以提高成骨活動(dòng)，促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨折愈合。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，淫羊藿苷可以改善骨質(zhì)疏松老年骨折大鼠愈合過(guò)程，這可能是通過(guò)提升軟骨內(nèi)成骨，加快礦化速度，增加骨痂和全身骨密度，促進(jìn)OPG的表達(dá)，從而加快老年大鼠骨質(zhì)疏松性骨折的愈合過(guò)程。

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