胃癌 BCG-823細胞對大鼠骨髓間充質干細胞CD34、CD44表達的影響

王玉萍 張 娟

(河南省中醫院 河南中醫藥大學第二附屬醫院腫瘤科，河南 鄭州 450002)

胃癌是我國發病率最高的消化道惡性腫瘤，發病隱匿，患病早期一般無消化道癥狀或癥狀不明顯，當患者出現胃痛等癥狀時多已進展至中晚期。中晚期胃癌的治療預后相對差，且腫瘤細胞可通過擴散進入血液和淋巴系統，進而傳播至全身各組織和器官。隨著精準醫療的發展，關于腫瘤精準治療的基礎研究進一步成熟，其中利用骨髓間充質干細胞(BMSCs)的腫瘤趨向性制作以BMSCs為載體的“生物導彈”成為新的研究熱點〔1～3〕。但BMSCs作為一個分化程度較低的細胞類型，在細胞微環境的影響下誘導分化的可能性增大，當以BMSCs為載體進行藥物遞送時載體細胞在腫瘤組織微環境中的誘導分化問題成為當前細胞遞送抗胃癌藥物的難點〔4～6〕。本研究將人胃癌BCG-823細胞與大鼠BMSCs共培養，分析其細胞形態及腫瘤標記物CD34、CD44的表達情況，旨在探析人胃癌BCG-823細胞模擬的胃癌組織微環境對BMSCs生長的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性健康SD大鼠6只，鼠齡2～3 w，質量(50.00±5.00)g，均購于凱學生物科技(上海)有限公司，自由進食，并在自然光照下飼養待用。

1.2人胃癌BCG-823細胞 購于江蘇菲亞生物科技有限公司，組織來源于62歲未分化胃腺癌患者，癌胚抗原(CEA)(+)；培養條件：RPMI1640+10%胎牛血清(FBS)；細胞形態呈上皮樣，貼壁生長；采購時均采用凍存的細胞干冰運輸。

1.3試劑與儀器 FBS、磷酸鹽緩沖液(PBS)、DMEM/F12培養液、FBS消化液均來自美國SIGMA公司；0.05%胰酶-EDTA、1%青鏈霉素混合液均來自Hyclone公司；MTT試劑盒、CD34/異硫氰酸熒光素(FITC)抗體、CD44/藻紅蛋白(PE)抗體均來自英國Cayman公司；采用ACEA Biosciences公司提供的ACEA NovoCyte流式細胞儀；Transwell小室由美國康寧公司提供。

1.4BMSCs培養 頸椎脫臼法處死6只SD大鼠，分離、剪斷股骨和脛骨，用DMEM/F12溶液將骨髓細胞沖出，吹打分離細胞后將骨髓細胞懸濁液移入離心管中離心棄上清，PBS重懸后移入15 ml離心管中，離心管內提前配好淋巴細胞分離液5 ml。2 000 r/min離心20 min，取白色渾濁的中間層(骨髓基質細胞層)，PBS反復沖洗2～3次后接種于25 cm2培養瓶中常規恒溫傳代培養。

1.5大鼠BMSCs共培養微環境對照的建立 共培養建立前準備Transwell小室2個，大鼠BMSCs傳至3代時分別以2×105(個)細胞量接種至預先準備好的Transwell小室。其中，對照組BMSCs接種于Transwell小室內，下層為DMEM/F12培養液，并加入10%FBS和1%青鏈霉素。觀察組BMSCs接種于Transwell下室，將Transwell上室置于6孔位板的孔中，Transwell上室接種2×105(個)人胃癌BGC-823細胞。兩組BMSCs均置于恒溫培養箱中培養7 d，培養條件為37℃、5%CO2。

1.6大鼠BMSCs共培養微環境對照的檢測 培養1～7 d，每天均采用MTT法檢測BMSCs的增殖情況，吸光度測定波長為490 nm，細胞增殖率=〔1 -(實驗孔A 值- 空白孔A 值)/(對照孔A 值- 空白孔A 值)〕×100%。每天鏡下觀察細胞懸濁及貼壁生長情況，觀察細胞形態變化。培養7 d后，采用流式細胞術(FCM)檢測BMSCs細胞分裂情況，計算G1、S、G2/M比率；并采用FCM檢測兩組BMSCs CD34、CD44表達情況，CD34采用FITC標記的羊抗鼠二抗，CD44采用PE標記的羊抗鼠二抗。

1.7統計學方法 采用SPSS23.0軟件。計數資料行χ2檢驗，計量資料行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組大鼠BMSCs生長形態變化情況 對照組BMSCs在原代培養1 d后即有少量細胞貼壁生長，培養液中仍有大量懸浮細胞；培養3 d時可見明顯貼壁細胞，分布分散，但已出現短梭狀、橢圓形等短平狀形態；培養7 d時可見明顯的貼壁細胞集落單位，細胞均勻、有序地鋪滿整個瓶底，且細胞形態改變為長梭形，鏡下觀察細胞輪廓不清，具有較強的折光性。觀察組BMSCs在原代培養1 d時與對照組細胞生長狀況相似；培養3 d時細胞貼壁生長現象不明顯，細胞核變小，且其細胞形態較對照組更細長；培養7 d時可見細胞形態較細長，且細胞間連接不緊密，排列紊亂，呈團狀生長，細胞形態不規則，與人胃癌 BCG-823細胞形態雷同。

2.2兩組BMSCs細胞分裂周期分布比較 培養7 d后，觀察組BMSCs G1周期占比明顯低于對照組，S周期占比及G2/M占比均明顯高于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組BMSCs細胞分裂周期分布比較

2.3兩組BMSCs增殖率比較 兩組BMSCs在培養1 d時細胞增殖率差異無統計學意義(P>0.05)；培養2～7 d時，觀察組BMSCs增殖率明顯高于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 兩組BMSCs增殖率比較

2.4兩組大鼠骨髓間充質干細胞CD34、CD44表達水平比較 培養7 d后，觀察組CD34陽性表達率明顯高于對照組，CD44陽性表達率明顯低于對照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 兩組BMSCs的CD34、CD44表達水平比較

3 討 論

腫瘤細胞在體內的集落與正常細胞不同，多表現為圓團形或不規則形。腫瘤細胞原癌基因和抑癌基因表達異常，生長周期失控表現為無限增殖，加細胞因子等表達改變，導致細胞的接觸抑制消失，且伴有較強的遷移性〔7,8〕。但腫瘤組織并非僅僅由腫瘤細胞構成，而是腫瘤細胞與間質細胞等多種類型細胞組成的異質混合體。研究表明，將人工誘導的多能干細胞iPSCs與腫瘤組織共培養可觀察到iPSCs向腫瘤組織分化的趨勢，其細胞形態和細胞因子表達狀態均明顯改變，并提出腫瘤組織微環境的概念〔9,10〕。腫瘤組織微環境是指腫瘤組織發生及發展時所處的內環境，主要是腫瘤組織及腫瘤組織細胞產生的細胞因子和組織液等。既往研究已表明，上皮來源的惡性腫瘤在腫瘤微環境影響下具有較強的間質轉化生物功能〔11～13〕。BMSCs是一種最常見的多能干細胞，與人工誘導分化程度較高細胞而得到的多能干細胞iPSCs相比，其分化能力更強，且通過動物骨髓小劑量獲取更方便。隨著對BMSCs的不斷研究，其在臨床治療中的應用逐漸深入。既往在臨床治療中的應用多為利用其多向分化和免疫排斥小的特點進行替代治療，但在嘗試用間充質干細胞作為藥物遞送載體的研究中發現其藥物遞送效果較差，且腫瘤組織甚至會進一步發展。

近年研究表明，間充質干細胞與胃癌組織的發展顯著相關，且間充質干細胞在胃癌微環境的誘導下能向胃癌細胞分化，并且影響干細胞表面CD34、CD44等標記物的表達〔14～16〕。CD34是在造血祖細胞等造血前體細胞中選擇性表達的跨膜糖蛋白，主要參與細胞間的黏附，在細胞的增殖分化及轉移中均具有重要意義。CD44是一種與細胞異質性黏附相關的跨膜糖蛋白，與腫瘤細胞的轉移性密切相關。CD34、CD44是BMSCs的重要標志物。本研究結果說明人胃癌BCG-823細胞提供的腫瘤微環境能對BMSCs分化產生誘導作用。通過對培養細胞增殖情況檢測顯示，人胃癌BCG-823細胞共培養的BMSCs分裂能力更強，考慮為BMSCs受人胃癌BCG-823細胞誘導分化后細胞生長抑制消除所致；并且人胃癌BCG-823可影響BMSCs CD34、CD44的分泌。

綜上所述，人胃癌 BCG-823細胞對大鼠BMSCs增殖速度及CD34、CD44表達具有顯著影響，并可誘導大鼠BMSCs向人胃癌 BCG-823細胞分化。

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