蘆國芳，安建雄，馬 鈞，錢曉焱，王 永，楊小榮

抑郁癥是危害人類健康和情感性行為的主要疾病之一。據Mathers和Loncar[1]預計，到2030年抑郁癥在全球疾病致殘率和經濟負擔的排名中將位居第二。Phillips等[2]2009年在英國TheLancet雜志上發表文章，稱中國抑郁癥的患病率為6.1%，按其比率推算，國內抑郁癥患者已達到9 000萬。由于抑郁癥發病機制尚不清楚,至今尚缺乏防治抑郁癥的理想方法。然而，已有大量研究表明大腦內小膠質細胞激活引起的神經炎癥在抑郁癥中扮有重要角色，此外，大量研究證實三氧可有效抑制機體炎癥反應[3]，已有研究表明小膠質細胞激活引起的炎癥反應是抑郁癥發生與發展的重要原因[4-6]。然而迄今尚無三氧防治抑郁癥的報道。本研究通過建立抑郁癥小鼠模型，檢測各組小鼠小膠質細胞數量與炎癥因子白介素(interleukin,IL)-1β，IL-6和腫瘤壞死因子(tumer necrosis factor- α,TNF-α)的表達水平，探究三氧對抑郁癥小鼠的防治作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C57BL/6J小鼠40只，清潔級，雄性，體重20～30 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證編號：SCXK(京)2016-0011；醫用三氧水由三氧氣體溶于500 mL的醫用滅菌水配制而成的，溶液為80 μg/mL由醫用三氧治療儀(德國，Ozomed Basic)完成；特制的50 mL離心管；曠場實驗系統(美國，Panlab，Harvard Apparatus)；免疫組化IBA1一抗(日本Wako公司)；逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒(康為世紀生物技術有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備 將40只小鼠隨機分為4組，即模型組、模型加三氧組、對照組和對照加三氧組(預防性干預及治療性干預小鼠數量和分組方法一致)，對模型組和模型加三氧組小鼠進行連續7 d每天1 h的束縛應激(為保證模型成功，每天束縛小鼠時間需一致)制備抑郁癥小鼠模型[7]。

1.2.1.1 三氧預防性干預 造模前3 d對模型加三氧組和對照加三氧組進行腹腔注射三氧水(80 μg/mL，0.1 mL/10 g)干預，模型組和對照組腹腔注射0.9%生理鹽水設為對照，1/2d，共5次。

1.2.1.2 三氧治療性干預 造模成功后，對模型加三氧組和對照加三氧組進行腹腔注射三氧水(80 μg/mL，0.1 mL/10 g)干預，模型組和對照組腹腔注射0.9%生理鹽水設為對照，1/2d，共5次。

1.2.2 行為學測試 自三氧干預結束起進行懸尾實驗(tail suspension test,TST)、強迫游泳實驗(forced swimming test,FST)、新環境抑制進食實驗(novelty suppressed feeding test，NSFT)和開放曠場實驗(open field test,OFT)行為學測試,實驗順序隨機，為期5 d。

1.2.2.1 TST 實驗前60 min，將小鼠移至安靜的測試房，以緩解動物緊張情緒。實驗時將小鼠尾巴用膠帶固定起來懸掛在實驗架(高于地面50 cm)上，實驗持續6 min，前2 min統計小鼠不動前的潛伏期時間，后4 min統計小鼠不動總時間，全程通過高清數碼攝像機記錄實驗過程[8]。

1.2.2.2 FST 實驗前60 min，將小鼠移至安靜的測試房，以緩解動物緊張情緒。實驗時將小鼠置于直徑15 cm，水深10 cm,水溫(20±2)℃的上方開口圓柱形玻璃容器中，實驗持續6 min，前2 min統計小鼠不動前的潛伏期時間，后4 min統計小鼠不動的總時間，全程通過高清數碼攝像機記錄實驗過程[9]。

1.2.2.3 NSFT 實驗前1 d將實驗小鼠換至新鼠籠，24 h后進行測試。實驗前60 min，將小鼠移至安靜的測試房，實驗時將小鼠置于40 cm× 40 cm×40 cm的上方開口的玻璃盒中，在玻璃盒的中央放置一白色器皿，其上放一顆鼠糧，從把小鼠放入玻璃盒中開始計時至小鼠開始進食為止，實驗持續5 min,若5 min內小鼠無進食，則記為5 min，全程通過高清數碼攝像機記錄實驗過程[10]。

1.2.2.4 OFT 實驗前60 min,將小鼠移至安靜的測試房并打開軟件記錄日期，小鼠標號后進行測試，實驗時將小鼠置于曠場實驗裝置60 cm×60 cm×60cm中心區域，通過曠場設備上方的攝像機及其相連的監視器觀察5 min內小鼠的活動情況，包括休息時間、運動距離與速度，進入中心區域的次數和時間，實驗結束后將小鼠放回籠內，用75%乙醇徹底擦拭實驗裝置，并用紙巾擦干[11]。

1.2.3 取材 實驗結束后，用配制好的10%的水合氯醛(10 μL/g)進行腹腔注射，待小鼠麻醉成功后剖開胸腔，從左心室插管，用加入肝素的生理鹽水進行心室灌注，灌注速度為8 mL/min。待肝臟顏色由粉紅變透亮后取出全腦或立即分離海馬、額葉和杏仁核組織，全腦組織立即固定于4%多聚甲醛溶液中進行免疫組化染色(immunohistochemistry,IHC)，分離的各個腦區的組織液氮凍存用于RT-PCR檢測。

1.2.4 IHC染色 4%多聚甲醛固定的小鼠大腦經過30%蔗糖脫水3 d，冰凍切片40 μm腦片浸泡于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)中，換成含3% H2O2PBS孵育10 min。用PBS洗一遍，加入封閉液(30 mg/mL 5%封閉液)，20%山羊血清(1xPBS)搖床孵育1 h。吸去封閉液，加入稀釋的IBA1一抗，搖床孵育過夜。用PBS洗3遍，加入相應的二抗(辣根過氧化物酶標記)，搖床孵育2 h。用PBS洗3遍，加入二氧基聯苯胺顯色液顯色5 min，然后將腦片在PBS中貼到陽離子包被的載玻片上，晾干后經乙醇梯度脫水二甲苯透明后用中性樹脂封片。

1.2.5 RT-PCR檢測 RT-PCR檢測額葉、海馬及杏仁核中IL-1β、IL-6和TNF-α含量水平。

1.2.5.1 RNA抽提 取液氮冷凍右側海馬組織勻漿Trizol試劑盒(Promega)抽提總RNA。

1.2.5.2 反轉錄合成cDNA 取1 μg總RNA,按照反轉錄試劑盒(Transgen)說明書逆轉錄合成cDNA。

1.2.5.3 實時定量PCR cDNA用UltraSYRB supermix with ROX1(康為世紀生物技術有限公司)進行PCR擴增，定量反應在Agilent Technologies Mx3005P定量PCR儀上進行。反應條件：94℃預變性3 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共進行40次循環。PCR引物由primer bank以及在線Primer 3.0軟件設計，訂購于Life Technologies公司。引物序列分別為：IL-1β，上游引物GCAACTGTTCCTGAACTCAACT，下游引物ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT；IL-6,上游引物TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC，下游引物TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC；TNF-α，上游引物CCCTCACACTCAGATCATCTTCT，下游引物GCTACGACGTGGGCTACAG。

2 結果

2.1 三氧預防性干預 預防性干預時間如圖1A。

2.1.1 行為學結果 在TST、FST、NSFT及OFT中，對照組與對照加三氧組各項行為學測試差異無統計學意義(F=4.056，P>0.05)。

2.1.1.1 TST 模型組不動之前的潛伏期時間較對照組短(F=2.303,P<0.05)，模型組潛伏期時間較模型加三氧組短(F=3.478,P<0.05)(圖1F),后4 min總的不動時間各組差異無統計學意義(F=3.807,P>0.05)(圖1E)。

2.1.1.2 FST 模型組不動之前的潛伏時間較對照組短(F=3.144,P<0.05),模型組潛伏期時間較模型加三氧組短(F=3.112,P<0.05)(圖1C)。模型組后4 min總不動的時間較對照組長(F=4.356,P<0.05)，模型組后4 min不動的總時間較模型加三氧組長(F=3.798，P<0.05)(圖1B)。

2.1.1.3 NSFT 模型組潛伏期時間較對照組長(F=3.499,P<0.05)，模型組較模型加三氧組潛伏期時間長(F=2.809,P<0.05)(圖1D)。

2.1.1.4 OFT 我們監測了小鼠行動軌跡圖(圖G)，運動距離與速度，休息時間，進入中心區域的次數與速度。從總區域運動距離與速度看，模型組運動距離較對照組短(F=4.528,P<0.05)，模型組運動距離較模型加三氧組短(F=2.478，P<0.05)。模型組運動速度較對照組慢(F=6.089,P<0.05)，模型組運動速度較模型加三氧組慢(F=3.125，P<0.05)(圖1H、1I)。從在中心區的休息時間看，模型組休息時間較對照組長(F=3.950,P<0.05)，模型組休息時間較模型加三氧組長(F=4.908,P<0.05)(圖1J)。就進入中心區域的速度來看，模型組較對照組運行速度慢(F=2.256,P<0.05)，模型組休息時間較模型加三氧組短(F=3.675,P<0.05)(圖1K)。從進入中心區域的次數可以看出各組比較差異無統計學意義(F=4.997,P>0.05)(圖1L)。

2.1.2 光鏡觀察各組小鼠同一部位海馬、額葉和杏仁核的小膠質細胞形態(圖2A)及數量變化 在海馬、額葉及杏仁核中，對照組與對照加三氧組小膠質細胞數量差異無統計學意義(F=3.456，P>0.05)。模型組額葉區小膠質細胞數量較對照組多(F=4.361,P<0.05)，模型組額葉區小膠質細胞數量較模型加三氧組多(F=3.112，P<0.05)。模型組海馬區小膠質細胞數量較對照組多(F=3.456,P<0.05)，模型組海馬區小膠質細胞數量較模型加三氧組多(F=4.005，P<0.05)。各組小鼠杏仁核區小膠質細胞形態及數量比較差異無統計學意義(F=6.012,P>0.05)(圖2B)。

2.1.3 RT-PCR檢測小鼠腦中額葉、海馬和杏仁核組織中炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平 對照組與對照加三氧組炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平比較差異無統計學意義(F=4.675，P>0.05)。額葉組織中，模型組炎癥因子TNF-α的水平高于對照組(F=2.265,P<0.05)，模型組TNF-α的水平高于模型加三氧組(F=4.556，P<0.05)，而2組IL-6、IL-1β的水平比較差異無統計學意義(圖2C)。海馬組織中，模型組炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平高于對照組(F=8.038,P<0.05)，模型組TNF-α、IL-1β的水平高于模型加三氧組(F=6.007，P<0.05)，而2組IL-6的水平比較差異無統計學意義(圖2D)(F=5.808,P>0.05)。杏仁核組織中，各組IL-6、IL-1β和TNF-α的水平比較差異無統計學意義(F=3.124,P>0.05)(圖2E)。

圖1 三氧預防性干預行為學

圖2 三氧預防性干預海馬、額葉、杏仁核區域小膠質細胞形態及數量

2.2 三氧治療性干預 治療性干預時間如圖3A。

2.2.1 行為學結果 在TST、FST、NSFT及OFT中，對照組與對照加三氧組各項行為學測試結果差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2.1.1 TST 模型組總的不動時間長于對照組(F=3.765，P<0.05)，模型組與模型加三氧組總的不動時間相比差異無統計學意義(F=5.234,P>0.05)(圖3E)。模型組潛伏期時間與對照組及模型加三氧組相比差異無統計學意義(F=6.096，P>0.05)(F=4.675，P>0.05)(圖3F)。

2.2.1.2 FST 模型組總的不動時間較對照組短(F=4.567,P<0.05)，模型組與模型加三氧組總的不動時間相比差異無統計學意義(F=2.788，P>0.05)(圖3B)。模型組潛伏期時間較模型加三氧組長(F=5.787，P<0.05)，模型組潛伏期時間與對照組相比差異無統計學意義(F=4.665，P>0.05)(圖3C)。

2.2.1.3 NSFT 模型組潛伏期時間較對照組長(F=3.004，P<0.05)，模型組潛伏期時間與模型加三氧組相比差異無統計學意義(F=3.487,P>0.05)(圖3D)。

2.2.1.4 OFT 我們監測了小鼠行動軌跡圖(圖3G)，運動距離與速度，休息時間，進入中心區域的次數與速度。從運動距離看，模型組與模型加三氧組及對照組比較差異無統計學意義(F=4.825，P>0.05)(圖3H)。從休息時間看，模型組休息時間較模型加三氧組短(F=2.404,P<0.05)(圖3I)。就進入中心區域的速度來看模型加三氧組與模型組比較差異無統計學意義(F=0.347,P>0.05)(圖3K)。從進入中心區域的次數可以看出，模型組進入中心區域次數少于對照組(F=3.665，P<0.05)，而模型組與模型加三氧組進入中心區域次數相比差異無統計學意義(圖3L)(F=1.761,P>0.05)。

圖3 三氧治療性干預行為學

2.2.2 光鏡觀察各組小鼠同一部位額葉、海馬和杏仁核的小膠質細胞形態(圖4A)及數量變化 在額葉、海馬和杏仁核區域，對照組與對照加三氧組小膠質細胞數量比較差異無統計學意義(F=6.453，P>0.05)。在額葉、海馬和杏仁核區域，模型組小膠質細胞數量均多于對照組(F=4.534，P<0.05)，模型組與模型加三氧組小膠質細胞數量比較差異無統計學意義(F=3.564，P>0.05)(圖4B)。

2.2.3 RT-PCR檢測小鼠腦中額葉、海馬和杏仁核組織中炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平 對照組與對照加三氧組炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平相比差異無統計學意義(F=4.895，P>0.05)。額葉組織中，模型組炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平高于對照組(F=5.674,P<0.05)(F=3.022，P<0.05)，而模型組與模型加三氧組IL-1β、TNF-α的水平相比差異無統計學意義(F=1.452,P>0.05)，各組炎癥因子IL-6的水平比較差異無統計學意義(F=4.052，P>0.05)(圖4C)。海馬組織中模型組IL-6的水平高于模型加三氧組(F=3.354，P<0.05)，模型組IL-6的水平與對照組相比差異無統計學意義(F=5.889，P>0.05)，模型組TNF-α的水平高于對照組(F=2.677，P<0.05),模型組與模型加三氧組TNF-α和IL-1β的水平相比差異無統計學意義(F=3.454，P>0.05)(圖4D)。杏仁核組織中模型組TNF-α的水平均低于對照組與模型加三氧組(F=3.948，P<0.05)，模型組IL-6的水平高于對照組(F=3.044，P<0.05)，模型組與模型加三氧組IL-6的水平相比差異無統計學意義(F=4.056，P>0.05)，各組炎癥因子IL-1β的水平比較差異無統計學意義(F=2.526,P>0.05)(圖4E)。

圖4 三氧治療性干預海馬、額葉、杏仁核區域小膠質細胞形態及數量

3 討論

抑郁癥又稱抑郁障礙，是常見的精神疾病之一，主要表現為情緒低落，興趣減低，悲觀，思維遲緩，缺乏主動性，自責自罪，飲食、睡眠差，擔心自己患有各種疾病，感到全身多處不適，嚴重者可出現自殺傾向和行為。目前治療抑郁癥的主要方法是抗抑郁藥，但常見的抗抑郁藥作用機制單一，且有頭暈、口干，心率加快等副作用，而產生耐藥反應及自殺傾向嚴重者則需采用電休克治療，電休克可有效治療重度抑郁癥，但存在一定的局限性[12]。本研究探索三氧對抑郁癥的預防及治療作用。

抑郁癥確切發病機制尚不清楚，大腦中小膠質細胞激活引起的神經炎癥扮有重要角色。小膠質細胞是腦內常駐免疫細胞，是機體抵御損傷和感染的第一道也是最主要的防線。在正常生理情況下，它主要起到免疫監視、免疫防御和組織修復作用[13]，適度激活小膠質細胞對神經元有保護作用，但過度激活則釋放大量炎性介質和神經毒性物質。有研究證實，源自小膠質細胞的促炎因子如IL-1β、TNF-α等會調制下丘腦-垂體-腎上腺皮質(hypothalamus-pituitary-adrenocorticalaxis,HPA)軸的活動，阻礙皮質激素對HPA軸的負反饋，造成HPA軸活動過度[4]，損傷情緒中樞神經可塑性[5]，降低腦中單胺類遞質如5-羥色胺等的含量[6]，從而引起抑郁癥發生與發展。

三氧有抗炎、抗感染、抗氧化及免疫調節等作用。有研究證實,大鼠腹腔注射三氧可減輕血液TNF-α炎癥因子表達，增強超氧化物歧化酶Orgotein活性,降低活性氧水平，達到抗炎，抗氧化作用[3]。三氧可減少糖尿病腎病模型大鼠腎病組織凋亡表達，降低腎臟組織中TNF-α、缺氧誘導因子-1α水平[14]，抑制糖尿病視網膜病模型大鼠血清炎性因子釋放[15]。因此我們推測三氧可能通過抑制腦小膠質細胞激活引起的神經炎癥反應，從而達到防治抑郁癥的目的。迄今尚未有關三氧防治抑郁癥的報道。

本研究采用束縛應激法成功建立抑郁癥小鼠模型，同時采用三氧干預，行為學測試發現，預防性三氧干預可有效減少小鼠抑郁行為，但治療性三氧干預卻未能減輕小鼠抑郁表型。進一步研究發現，預防性三氧干預可減少小鼠腦內海馬、額葉和杏仁核區域小膠質細胞數量，降低IL-6、IL-1β與TNF-α等炎癥因子水平。然而，治療性三氧干預卻未能抑制小膠質細胞的激活與炎癥因子表達。

本研究發現三氧對小鼠抑郁癥發生有一定預防作用，但無治療效果，可能與下列因素有關：①三氧可有效抑制抑郁癥早期神經炎癥，但對小膠質細胞被充分激活后形成的神經炎癥效果較差；②三氧的濃度和量可能與抑郁癥防治效果相關。本研究中三氧濃度及劑量為單一的80 μg/mL，0.1 mL/10 g，結果顯示對小鼠抑郁發生有一定預防效果，但無治療作用。未來多種濃度和劑量進行干預將有利于發現三氧對抑郁作用的治療窗口；③治療效果可能也與給藥途徑有關。例如三氧大自血療法已廣泛應用于臨床，三氧與血液結合后可激活免疫活性細胞，使干擾素、白介素等細胞因子的釋放增加，進而增強機體免疫及抗炎能力。本研究結論僅基于三氧水腹腔注射，大自血療法抗抑郁作用有待進一步研究。

綜上所述，一定濃度和劑量三氧水腹腔注射對預防小鼠抑郁癥發生有一定作用，其機制可能與減少小鼠腦內海馬、額葉和杏仁核區域的小膠質細胞數量，降低小鼠腦中海馬、額葉及杏仁核區域炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平有關。但本研究未發現三氧水腹腔注射對已經形成的抑郁小鼠模型有治療效果。

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