婦產科專科生物樣本庫的建設和管理

李 倩，金莉萍

生物樣本庫也叫生物銀行，主要是指標準化收集、處理、儲存和應用健康和疾病生物體的生物大分子、細胞、組織和器官等樣本以及與這些生物樣本相關的臨床、檢驗、治療、隨訪、知情同意等資料及其質量控制、信息管理與應用系統[1]。生物樣本庫的主要優勢是快速高效地訪問集合的人類生物材料和相關的臨床信息。這些收集和保存完好的資源能節約重大研究成果的時間從而提高研究的競爭力，并加速推動科學進步[2]。

作為一家三級甲等婦產科專科醫院，上海市第一婦嬰保健院擁有豐富的婦科和產科疾病資源。為了收集及整合各臨床科室分散的臨床疾病資源，我院于2014年底開始籌建面對全院各臨床科室的生物樣本庫。主要職能是標準化、高質量地采集、處理、儲存和利用組織、血液、體液等婦產科臨床疾病資源，為婦產科相關疾病的臨床研究提供科研材料。高質量的保存臨床樣本，形成樣本庫動態存儲和使用的模式，促進臨床樣本資源對醫院臨床研究和基礎科研的支持，帶動臨床、科研和教學工作[3]。

目前我院已建成分區明確、布局合理、功能齊全的規范化樣本庫場地。收集范圍包括產科、婦科、乳腺腫瘤、出生缺陷、習慣性流產等方面的標本。樣本庫的職能包括腫瘤組織和血液、臍帶血、胎盤、絨毛、胸腹水、羊水等標本的前處理；核酸蛋白提取純化和質量控制；病理蠟塊和切片的制備和質控；組織芯片的制備等。建立了一套標準化、規范化的樣本采集、處理和儲存操作流程和質量管理體系。作者主要介紹在婦產科專科生物樣本庫建立過程中所積累的經驗和遇到的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 場地 生物樣本庫位于門診樓三樓，設有分區和功能明確的獨立專屬場地，按功能分為樣本接收間、樣本處理實驗室、RNA實驗室、細胞實驗室、超低溫冰箱間、液氮儲存間等功能區，其中樣本接收間主要用于臨床標本的接收和暫存、樣本信息資料錄入等，樣本處理實驗室能完成對樣本的初步處理(如離心、分裝等)，根據特殊樣本處理需求亦可在樣本處理實驗室、細胞實驗室、RNA實驗室完成對樣本的深度加工(如核酸與蛋白的提取、細胞的培養與保存等)，樣本存儲區(超低溫冰箱間和液氮儲存間)的儲存規模可達百萬份(圖1)。

圖1 生物樣本庫功能分區布局示意圖

1.1.2 設備和試劑耗材

1.1.2.1 樣本處理和儲存設備 生物安全柜(美國Thermo公司)、臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)、血液離心機(德國Sigma公司)、低溫標簽打印套裝(美國Brady公司)、移液器套裝(德國Eppendorf公司)、高壓滅菌鍋(日本三洋公司)、制冰機(日本三洋公司)、核酸提取純化系統(北京百泰克公司)；樣本質控設備：Nanodrop one紫外分光光度計(美國Thermo公司)、生物分析儀(美國安捷倫公司)；樣本儲存設備：超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司)、溫濕度監控系統(青島海爾特種電器有限公司)、氣相液氮罐(美國MVE公司)。

1.1.2.2 試劑耗材 真空采血管(江蘇康健醫療用品有限公司)、無菌注射器(江蘇康健醫療用品有限公司)、凍存管(上海萬格科學器材有限公司)、凍存盒(上海萬格科學器材有限公司)、RNAlater保存液(美國Ambion公司)、核酸提取試劑盒(北京百泰克公司)、蛋白定量試劑盒(美國GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 組織建設和人員培訓 參照國內較成熟樣本庫的建設模式，結合醫院自身特點，樣本庫組織架構由5部分組成：管理委員會、學術委員會、倫理委員會、生物安全評審委員會、執行機構。在此基礎上安排專人分別負責樣本的采集和前處理、核酸蛋白提取和質量管理、樣本信息數據管理、樣本出入庫和常務管理等，并按照崗位職責的不同給予相應的培訓內容、方式、要求和頻率，定期參加生物樣本庫標準化建設會議[4]。

1.2.2 知情同意書的簽署 樣本庫的建立和知情同意書的內容均經過院倫理委員會審查，嚴格保護患者隱私和權益[5]。樣本庫收集標本必須先征得患者的知情同意，主要是同意收集其血液樣本、手術切除的組織樣本或分娩后的胎盤附屬物等以及相關臨床診療信息用于科學研究。為方便和患者溝通，簽署知情同意書主要由經治醫生在術前談話時完成。

1.2.3 血液標本的采集和處理 術前血采集由病房護士完成，臍帶血由樣本庫人員在剖宮產術中抽取，抗凝血樣(乙二胺四乙酸抗凝管)和非抗凝血樣(無添加劑)各采集1管，每管5 mL；經1 600 g離心15 min后分離血清、血漿、血凝塊，并通過淋巴細胞分離液提取外周血單核淋巴細胞后分別裝入凍存管并保存在-80 ℃冰箱中，整個過程要求在2 h內完成。

1.2.4 組織樣本的采集和處理 組織樣本的采集在手術室標本離體后進行，婦科標本取腫瘤、癌旁和正常組織，產科標本取胎盤、臍帶、胎膜組織，采集并分裝完成后立即置于液氮中速凍或放入RNAlater保存液中保存。為保證組織標本的質量，從組織離體到組織凍存的時間最長不超過30 min[6](圖2)。

注：N代表正常組織；P代表癌旁組織；T代表癌癥組織圖2 婦科腫瘤組織樣本的處理流程

1.2.5 樣本接收和入庫管理 工作人員在接收樣本前核對樣本、知情同意書和樣本采集登記表，確認無資料缺失、信息不符、樣本泄露或質量問題后方能接收。將樣本信息錄入樣本庫管理系統后，系統根據樣本庫定義的規則輔助生成樣本編號并自動生成二維條形碼，自動為多個樣本復份分配儲存位置，完成樣本的入庫。

1.2.6 樣本資源的使用和出庫 為規范樣本庫標本的申請和使用，合理、有效地發揮資源優勢，督促樣本的使用和產出，院內外申請者使用樣本前，必須填寫樣本申請表，并經過院倫理委員會、科教科等審核通過后樣本方能出庫。樣本出庫前，樣本管理人員在管理系統中按條件篩選出符合申請者要求的樣本，選擇出庫并打印出庫單，按照出庫單上的樣本儲存位置在相應冰箱/液氮罐中取出樣本，復核無誤后完成樣本的交接。

2 結果

2.1 樣本和信息收集情況

2.1.1 樣本收集情況 樣本庫建設之初，主要以收集婦科各類惡性腫瘤的組織和血液標本為主。隨著樣本庫場地的擴大和各類軟硬件設施的完善，醫院內部各個科室對樣本庫作用和地位日益重視，各科室積極主動地配合各類有研究意義病種的樣本收集和保存工作。在此基礎上我們分別建立了針對醫院各個科室的不同類樣本的收集和保存流程。目前樣本庫的收集范圍涵蓋了婦科、產科、生殖免疫科、輔助生殖科、新生兒科、兒童保健科等科室的多個病種。現已庫存29個病種70 000余份樣本，所有樣本在收集前患者均簽署了知情同意書(圖3)。

圖3 生物樣本庫歷年樣本總數和病種數統計

2.1.2 樣本信息收集情況 樣本庫采用朗珈樣本庫管理系統，通過醫院信息科，實現了樣本庫管理軟件與住院醫生工作站、病理系統、檢驗系統、手麻系統、影像系統等的對接，可將患者的基本信息以及相關診療信息自動導入樣本庫管理軟件。臨床隨訪信息的采集和登記由專人管理，樣本庫定期收集樣本隨訪信息并將其錄入樣本庫管理系統。

2.2 樣本的質量控制 獲取高質量的樣本和相關臨床資料對于基礎醫學和轉化醫學研究至關重要。為了保證樣本的質量，樣本庫參照國外的標準化建設指南[7-10]，建立了一套符合婦產科疾病特色的樣本庫質量管理體系文件，規定了對不同類型標本的質控流程和標準以及樣本的抽檢方案。根據病種類型、樣本類型、儲存方式的不同，采用隨機抽取的原則，每月對新入庫腫瘤組織標本100%進行形態學檢測，隨機抽取5%的新入庫樣本進行分子質量檢測，隨機抽取10%的新入庫樣本進行信息核對。

2.2.1 組織形態學質量檢測 主要針對婦科腫瘤組織做形態學質控，對樣本進行病理形態學評估，在鏡下觀察腫瘤組織病理形態學信息，包括腫瘤成分比例、是否有組織壞死、是否有淋巴細胞浸潤等[11]。對于冷凍組織樣本，在手術室取材時，單獨留取一塊組織速凍，取材完成后制作冷凍組織切片，染色后鏡下進行病理形態學質控。對于石蠟組織樣本，在常規石蠟取材時，單獨留取一塊組織，制作石蠟組織切片，蘇木精-伊紅染色后進行病理形態學質控。鏡檢下腫瘤成分比例在60%以上視為腫瘤取樣合格。

2.2.2 分子學質量檢測 主要從樣本中提取DNA、RNA和蛋白質，檢測其濃度、純度和完整性[12]。核酸提取用全自動核酸提取儀，自動化提取樣本中的DNA/RNA，然后用超微量分光光度計檢測DNA/RNA的濃度和純度，用生物分析儀檢測DNA/RNA的完整性。采用TCA(三氯乙酸)-丙酮沉淀法人工提取組織中的蛋白質，用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度和總量，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測蛋白。從樣本庫的組織樣品中提取的蛋白質濃度均大于1 μg/μL，總量均大于100 μg，蛋白條帶分明，未發生明顯降解(圖4)，可滿足后續科研應用。

圖4 蛋白SDS-PAGE電泳結果

2.2.3 樣本信息質控 對樣本信息進行隨機抽檢，每個月從新入庫的樣本中抽取10%進行樣本相關信息和位置核對，主要檢查樣本相關臨床信息是否正確和完整、是否有隨訪信息、樣本條碼是否正確、實體庫與虛擬庫的位置是否一一對應，相關樣本記錄是否完整。經隨機抽檢和核對，95%以上樣本信息完整，約99%的樣本位置信息正確。

2.3 樣本庫取得的科研成效 樣本庫出庫的樣本和信息支持了我院國家自然科學基金、上海市科委、上海市衛計委、同濟大學醫學院等各個級別科研課題的立項。以2016年為例，生物樣本庫共支持了6項國家自然科學基金資助課題的研究。樣本庫的出庫量約占同時期樣本入庫量的8%。同時，生物樣本庫已獲得關于樣本取材、轉運和保存方面的3項專利授權。

3 討論

3.1 建設婦產科專科生物樣本庫的意義 目前女性生殖系統很多疾病發病機制不明，缺乏大規模流行病學調查數據，診治困難，缺乏診治規范，亞學科亟待發展。尤其是乳腺腫瘤和婦科腫瘤是嚴重危及人類生命的疾病之一，多年來一直是臨床和基礎研究領域最受關注的問題。研究婦科腫瘤生物學特性、臨床治療的有效性、防止腫瘤的復發和轉移是亟待解決的難題。生物樣本庫可以為相關研究提供病變和正常對照標本以及相關的臨床數據。科研人員可通過對海量數據的研究，獲知疾病的發病機制、發現新的疾病診斷和治療標志物，從而發現新的疾病干預、檢測和治療方式。生物樣本庫在婦產科臨床和基礎研究中的作用越來越被人們所重視。

3.2 規范樣本收集流程，保證樣本來源是生物樣本庫運行的難點 由于樣本收集范圍涉及到全院各臨床科室，樣本的采集工作需要臨床醫護人員配合。由于臨床醫護人員不熟悉樣本收集流程和操作規范，常造成知情同意書的簽署不規范、樣本漏收、樣本延遲運送造成的質量問題等。經過與臨床相關人員的溝通，不斷完善和規范臨床樣本收集流程，使之更好地適應臨床現有流程，如婦科腫瘤患者的血液采集可安排在術前一天和檢驗科抽血一起進行，以減少患者痛苦。通過幾次集中地針對全院臨床醫護人員的樣本收集流程和操作規范培訓，樣本的臨床采集流程問題得到了解決，知情同意書的簽署、臨床樣本的收集、樣本的運送流程得到了很好地銜接。

與其他腫瘤相比，婦科腫瘤病理類型多、病灶小且不明顯，因此存在各類樣本取材不規范的問題，直接影響了所收集樣本的質量。特別對于腫瘤組織樣本，取材的準確性直接影響了科研結果的可靠性[13]。而對于產科標本，如羊水、胎盤、絨毛等類型標本的收集，由于缺乏收集經驗，故需查閱相關文獻，并同產科相關科研人員溝通確定樣本收集的目標和以后的應用方向，確定樣本收集和前處理、保存方式。建立各類樣本的標準化操作流程，對樣本從取材、運輸、處理到保存的每個步驟均有標準化的規定，以保證樣本在采集及儲存期間能夠保持其生物學穩定性，可用于進一步實驗研究[14]。對于婦科腫瘤組織樣本，取材人員需通過我院病理科為期3個月的婦科腫瘤取材培訓，通過后方能上崗，以保證組織取材的準確性。

3.3 樣本庫持續有效運營亟需解決的問題 目前我院生物樣本庫建設的資金主要來源于醫院自籌資金，服務對象主要是醫院內部的研究人員。而樣本庫的長期穩定運行需要充足可靠的資金來保障。樣本庫進入慣性運營階段后，對外開放服務收費可作為日常管理費用的有效補充[15]。因此，建立樣本庫對外開放合作和收費機制，對樣本庫可持續發展和運營具有積極意義。遺憾的是，在樣本庫對外共享和收費模式方面，目前國內并沒有可借鑒的條例和規范。現狀是醫院外的研究者較難獲得醫院生物樣本庫的資源，共享機制尚未完善[16]，衛生行政管理部門對生物樣本庫的監管缺失。為此，建議我國應通過政府相關部門盡快制定相關運營和管理規范，加強生物樣本庫的管理規范制定和運行監管，促進生物樣本庫科學、有序發展，使生物樣本的有限投入發揮更大作用。

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