比色法輔助下紫外分光光度法測定黃芪總黃酮含量

陳凌霆，趙婭敏，齊燕姣，羅興平，康淑荷，張麗麗，俞布仁,楊文亮

(1.西北民族大學化工學院，甘肅 蘭州 730000;2.西北民族大學甘肅省高校環境友好復合材料及生物質利用省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000;3.西北民族大學電氣工程學院，甘肅 蘭州 730000)

豆科植物黃芪(Radix Astragali)是世界上最受歡迎的補氣藥物之一，用于強化氣[1]傳統上，黃芪通常由黃芪或桔梗變種的干燥根制備而成，具有強心，保肝，降血脂，抗菌消炎等活性[2]。本文以甘肅榆中縣產地的黃芪中藥為研究對象，蘆丁作為對照品，測定波長為512nm，在顯色法的輔助下，采用紫外-分光光度法測定中藥黃芪中總黃酮含量，擬建立測定黃芪中總黃酮含量的簡便高效方法，為黃芪的進一步研究與開發提供一定的參考依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

瑞士梅特勒電子天平(AB204-S)；分光光度計(T6)；旋轉蒸發儀(DFT-200)等。

1.2 藥品

蘆丁對照品(上海融禾醫藥科技發展有限公司)、黃芪(甘肅榆中藥店)經西北民族大學化工學院齊燕姣教授鑒定為膜莢黃芪；實驗室常用藥品、試劑，為分析純。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量的提取

準確稱取2.000g被粉碎黃芪后于回流裝置中用95%乙醇(料液比1∶10)，80℃溫度下回流1h，冷卻過濾；用石油醚萃取1-2次，萃取劑用量約為提取液的一半，蒸發濃縮，定容，制得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

準確稱取蘆丁標準品5mg，烘干后置于容量瓶(50mL)中，加50%乙醇水浴加熱溶解并定容，即得蘆丁標準溶液(0.1mg/mL)，放入冰柜備用。

2.3 最大吸收波長的確定

顯色劑(5%NaNO3-8%Al(NO3)3-5%NaOH)顯色后，在空白組對照下，測得供試品溶液的最大吸收波長，由圖1可知，在460～560nm范圍內最大吸收波長為512nm。

圖1 最大吸收波長曲線

2.4 蘆丁標準曲線的制作

分別量取標準溶液0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mL，置于容量瓶(50mL)，用50%乙醇加至25mL，加1.5mL NaNO2溶液(5%)，搖勻，放置3min，加入10%Al(NO3)3溶液1.5mL，搖勻，放置3min，再加入5mL 5%NaOH溶液，靜置5min，用50%乙醇定容；以0.0mL標準溶液組作為空白對照組，在512nm波長紫外光下測定吸光度，并繪制標準曲線(圖2)，結果表明蘆丁對照品濃度0.015～0.6mg/mL時，線性關系良好。

2.5 實驗條件的優化

總黃酮測定中常用的顯色試劑為NaNO2、Al(NO3)3與NaOH。而影響供試品溶液顯色的因素有很多，如用于顯色的化學試劑的選擇、溫度、作用時間等對吸光度的測定均會有一定的影響。另有相關研究[3-4]表明，NaNO3-Al(NO3)3-NaOH顯色劑在測定植物總黃酮含量中顯色效果良好，加入pH緩沖液和Al3+離子溶液，顯色效果良好，因此本次試驗通過對顯色劑濃度、堿性溶液濃度的改變來確定最佳條件。

2.5.1 Al(NO3)3濃度的選擇

移取供試品溶液，按照“2.4”方法，加入系列濃度梯度值的Al(NO3)3溶液配成待測樣品，探究不同Al(NO3)3溶液濃度對吸光度值之間的關系,見圖1。

表1 NaOH濃度與吸光度的關系

結果表明，8%Al(NO3)3溶液條件下，測得的吸光度值最好。

2.5.2 NaOH溶液濃度影響

移取供試品溶液，按照“2.4”方法，加入系列濃度梯度值的NaOH溶液配成待測樣品，探究不同NaOH溶液濃度對吸光度值之間的關系，見表2。

表2 NaOH濃度與吸光度的關系

結果表明，5%NaOH溶液條件下，測得的吸光度值最好。經過實驗條件優化發現在顯色條件為5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH時進行測定實驗最佳。

2.6 精密性實驗的測定

準確量取中藥黃芪供試溶液，按照“2.4”項下方法制備待測溶液，以5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH為顯色劑，在512nm波長下連續測定5次吸光度，結果見表3。

表3 精密性測定

由表3可看出RSD(%)=0.23，表明該方法精密度良好。

2.7 穩定性實驗的測定

室溫下吸取供試品溶液，分別在有、無光線的條件下，靜置不同時間，測定其吸光度，結果見表4、表5。

表4 光線條件下穩定性的測定

表5 無光條件下穩定性的測定

按上述兩表格繪圖如(圖3)。

圖3 有光和無光穩定性測定

從表4、表5及圖3可知，在有光和無光條件下其RSD(%)分別為0.50和0.37，曲線變化趨勢溫和，說明該實驗在室溫條件下40min內較為穩定。

2.8 重現性實驗的測定

稱取供試液5份，按照“2.4”項下方法制備待測樣品，加入顯色劑(5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH)，測定512nm處吸光度，并計算黃芪總黃酮含量，結果見表6。

表6 重現性測定結果

根據表中結果可看出，RSD(%)=2.39本方法重現性良好。

2.9 加樣回收率的測定

將干燥黃芪藥材6份，分成3組，每組質量分別為1g、2g、3g，并制成試劑，吸取2mL該溶液置于容量瓶(50mL)中，然后分別加入不同體積的蘆丁對照品溶液，照“2.4標準曲線繪制”項下方法，加入顯色劑(5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH)，配成待測溶液，在512nm處測定吸光度，求得平均回收率為97.6%，RSD(%)=2.47。

2.10 樣品含量的測定

準確稱取干燥的黃芪藥材2g，將這藥材分成3組制成供試品溶液，再各準確吸取20mL供試品溶液，各置于容量瓶(50mL)中，加50%乙醇定容，加入顯色劑按(5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH)，在512nm波長下測其吸光度，并算出黃芪總黃酮含量，見表7。

表7 樣品含量測定結果

結合整個實驗結果分析表明，在5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH顯色條件下，測得甘肅榆中縣黃芪總黃酮平均含量為1.09%，實驗回收率為97.6%。實驗中的精密性、重現性、加樣回收率的RSD(%)分別為0.23、2.93、2.47，穩定性在有光和無光下的RSD(%)為0.50、0.37都符合要求。

3 討論

亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法是《中國藥典》中總黃酮測定常見方法，其基本的顯色原理：黃酮分子中羥基可與Al3+、Mg2+發生作用，生成有色的金屬絡合物，即可進行定性定量分析[1]。因供試品溶液中成分比較復雜，如果只采用紫外分光光度法則存在較大誤差，故實驗選擇紫外分光光度法和顯色法相結合。本實驗探究了Al(NO3)3濃度和NaOH濃度與吸光度值之間的關系，發現在一定Al(NO3)3濃度、NaOH濃度區間內，吸光度值較高，區間外的吸光度值明顯較低。顯色劑的濃度也是整個比色法測定黃芪中總黃酮含量實驗的一個重要關鍵因素，由相關的文獻表明顯色后最大吸收波長處的吸收強度是選用顯色劑的主要依據[5]，在一定范圍內，AlCl3加入量的增大，吸光度反而減小，造成顯色不穩定。

因此，本研究方法中顯色法最佳條件為5%NaNO3-8%Al(NO3)3-5%NaOH，最大吸收波長為512nm，線性方程為A=0.0741c+0.0005，總黃酮的回收率為97.6%，相對偏差(RSD)為2.47%。此法重現性高、穩定性好、回收率高，可為今后黃芪藥物開發利用提供進一步理論依據。