大白菜小孢子培養中的污染問題及防治對策*

王秀英 蘭創業 趙軍良 李改珍

（山西省農業科學院蔬菜研究所，山西 太原 030031）

組培過程中，培養基和培養材料受外界真菌、細菌或培養材料的內生菌侵染滋生雜菌，導致組培失敗，稱為組培污染[1]。從污染產生的病原來看主要有真菌和細菌兩類[2]，操作不當、外植體消毒不充分、培養基及工具消毒不過關、無菌操作室消毒時間過短、無菌操作程序不嚴格等都會造成污染[3]。各種因素引起的組培污染一直最大程度地制約著組培技術的發展[4]。

我們在大白菜游離小孢子培養過程中發現，花蕾的選擇、清洗、消毒、研磨、離心、分裝、培養等環節的操作都要嚴格按照操作規程，否則極易造成污染。目前，國內報道較多的影響大白菜游離小孢子胚誘導率的因素有基因型[5～10]、小孢子發育時期[11～12]、培養方式[13]、供體植株生長環境條件[5，14～15]等，影響胚誘導再生植株的因素有胚的類型、培養基水分狀況、活性炭[16～17]等，而對培養過程中存在的污染問題及防治措施報道較少。

大白菜的開花期有1個月左右，始花期后期和盛花期前期是小孢子培養取材的最佳時期，適宜取材接種的時間很短，只有10 d左右，培養過程中應盡量避免污染導致培養失敗。多年來我們一直從事大白菜小孢子培養工作，在培養過程中的污染問題及防控措施方面積累了一些經驗，現將其介紹如下。

1 污染問題

1.1 細菌性污染

培養過程中肉眼觀察到培養基呈黏稠狀或顯微鏡觀察到細胞已團集而不再均勻分散，是細菌性污染的主要癥狀，一般在接種后1～3 d即可發現是否發生細菌性污染。細菌性污染一般由接種工具、培養基、洗液、無菌水、花蕾等消毒不徹底，操作不規范造成的。

1.2 真菌性污染

真菌性污染常發生在培養后期，培養基上出現黑、綠、紅、黃、白不同顏色，不同大小的菌斑是發生真菌性污染的癥狀。真菌性污染發生的主要原因有存放培養基的環境中真菌孢子濃度過大、培養基瓶口密封不嚴、接種材料多、接種時間長、超凈工作臺濾網不干凈、空氣中有真菌孢子漂浮等。真菌性污染的發生癥狀會隨著培養時間的延長而表現出來。

2 防治對策

游離小孢子培養接種前要認真挑選材料、嚴格滅菌，接種時規范操作，接種后調控培養環境，嚴防病原菌侵入，將污染率降到最低。

2.1 接種前

2.1.1 試驗材料的選擇

選擇無蟲眼、無裂縫、表面光滑的花蕾和清澈透明的培養基作為試驗材料，避免消毒不徹底而造成污染。

2.1.2 培養基滅菌

花粉培養用的NLN液體培養基主要通過過濾除菌，一般需過濾2～3次，過濾每L培養基需耗時10多h，將過濾后的培養基分裝于不同的三角瓶中，在常溫下觀察1周多。如果污染嚴重，第2 d培養基就會出現渾濁；如果污染輕微，第2 d、第3 d培養基仍然透明，但隨著時間的延長會看到白色棉絮狀漂浮物由小變大。液體培養基除菌過程中的過濾器及相關器皿都要嚴格消毒，并在超凈工作臺上進行過濾。

2.1.3 B5洗液、無菌水、接種工具等高壓蒸汽滅菌

滅菌前設定溫度和時間，冷空氣要排放干凈，避免壓力表上的溫度和壓力指標與鍋內實際溫度和壓力不符而導致滅菌不徹底；液體最多占容器體積的2/3，避免液體沖破封口膜造成污染；固體器皿包裹后均勻擺放在鍋內，切不可擁擠堆放使蒸汽流通和熱交換受阻，導致滅菌不徹底；滅菌結束后，待指針歸零時才能取出消毒物品，切忌打開放氣閥急速放氣，降溫太快會導致滅菌不徹底。根據滅菌對象不同，滅菌時間長短也不同。洗液、無菌水等液體，滅菌時間為30 min左右，需冷卻后使用；燒杯、試管、玻璃棒、離心管、吸管、鑷子、培養皿等器皿，滅菌時間為20 min左右，滅菌后將器皿放入烘箱烘干備用。

2.2 接種過程中

2.2.1 接種室和超凈工作臺的滅菌

保持接種室清潔，定期打開紫外燈殺菌，接種前噴灑75%酒精降塵；接種前打開超凈工作臺的紫外燈殺菌20～30 min，提前20 min打開鼓風機，保證超凈工作臺內部氣流暢通，勤洗過濾網，使空氣潔凈無雜菌；接種前對臺面、試管架、酒精瓶及工具進行徹底消毒。接種時用75%酒精擦拭雙手，點燃酒精燈，拉下擋風玻璃，僅夠接種人員伸入雙手操作即可。

2.2.2 材料表面的消毒

挑選好的花蕾先用自來水沖洗干凈，然后在超凈工作臺上用75%酒精浸泡約30 s后迅速浸入0.1%升汞溶液中消毒5～10 min[18]，或用7%次氯酸鈉消毒15 min。材料消毒后用無菌水沖洗3次，每次5 min。

2.2.3 研磨和過濾

將鑷子和玻璃棒蘸上酒精在酒精燈外焰上充分灼燒，冷卻后備用；將離心管和濾斗用鑷子夾夾在一起放到試管架上。整個操作過程忌互相碰撞，接觸部位需在酒精燈上灼燒消毒。將消毒后的花蕾放入試管內，倒入一定量的洗液，用玻璃棒輕輕擠壓，使其散出花粉，將濾液過濾至離心管，蓋緊蓋子并用封口膜封好管口再離心。

2.2.4 離心和分裝

離心2～3次，每次離心后都要在超凈工作臺上用75%醫用酒精擦拭雙手和離心管外壁。離心后棄上清液，倒入適量培養基，懸浮后分裝于培養皿內。分裝時管口要在酒精燈上滅菌，吸取添加物前對吸管口也要滅菌。分裝后，用封口膜把培養皿封嚴，阻斷內外空氣對流，避免污染。

2.3 接種后

保持培養箱清潔，用75%醫用酒精擦拭內壁，設定好溫度和濕度。注意濕度的設定，濕度大了易造成污染，濕度小了空氣干燥，封口膜易裂開造成污染。

3 其它防治對策

NLN培養基中應加入一定濃度的抗生素或殺菌劑，以防內生菌污染，NLN培養基常溫下過濾除菌后，不會造成抗生素或殺菌劑的分解，但要通過試驗篩選出抗生素或殺菌劑的最佳使用濃度。控制污染、建立潔凈培養環境、無菌的植株系統是組培育苗成功的三要素[19]。