石膽酸腺苷的合成研究

徐蒙蒙，胡越高，陳 峰，楊學軍，趙志剛，楊鴻均

(西南民族大學 化學與環境保護工程學院,四川 成都 610041)

腺嘌呤核苷是核酸的重要堿基，可對其結構的糖基和堿基進行修飾得到腺苷衍生物，并且其堿基與糖基間無糖苷鍵，因此對磷酸化酶具有較強的穩定性[1]。腺苷衍生物具有抗病毒[2]、抗腫瘤[3]、鎮靜、催眠和腦保護[4]、舒血管降壓、減慢心率[5]、有鈣拮抗劑[6]等生理活性。如環甲糖類腺苷類似物可作為HIV抑制劑[7]，單磷酸阿糖腺苷是一種腺嘌呤核苷類抗病毒藥物。它可抑制乙肝病毒的復制，從而達到轉陰的作用，臨床上主要用于治療慢性乙肝[8]。泛昔洛韋是能夠抑制共價閉合的環狀DNA病毒形成的核苷衍生物，它可以有效的抑制病毒復制[9]。阿地福韋酯為嘌呤類核苷類似物。具有抗病毒作用，對淋巴管平滑肌瘤(LAM)和貓杯狀病毒(FCV) 耐藥的乙肝病毒(HBV) 病毒株具有很強的抑制作用[10]。恩替卡韋是一種2'-戊環脫氧尿嘌呤核苷類似物，是抗乙肝病毒的核苷類藥物，具有極強的抗乙肝病毒能力，對拉米夫定耐藥的患者有很好的抗乙肝病毒治療作用[11]。因此，將藥物小分子嫁接至腺嘌呤核苷上，形成新的腺嘌呤核苷衍生物，是發現新藥的重要途徑。

甾體類化合物石膽酸是一種次級膽汁酸，存在于高等脊椎動物膽汁中。其分子結構中既含有親水基團，又含有疏水基團，故膽汁酸的立體構型具有親水性和疏水性兩個性質，因此使膽汁酸具有很強的界面活性。經查閱文獻發現石膽酸具有較多的藥理活性，如：抑制腫瘤生長、選擇性殺死乳腺癌癌細胞、選擇性抑制哺乳類DNA聚合酶的活性等[12-13]。我們期望以石膽酸為原料，來合成具有生物活性的小分子抑制劑石膽酸腺苷，其合成路線如圖1。

圖1 石膽酸腺苷合成路線 Fig.1 Synthesis route of Lithocholen acid adenosine

1 實驗部分

1.1 化學試劑及儀器

腺苷、叔丁基二甲基氯硅烷、羰基二咪唑、1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯(DBU)、石膽酸、四丁基氟化銨三水化合物購自上海泰坦科技股份有限公司。二氯甲烷、咪唑、氨基磺酰氯、乙酸、氫化鈉、四氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、乙二醇二甲醚(DME)購自成都市科龍化工試劑廠。二氯甲烷經氫化鈣干燥重蒸后使用，四氫呋喃經金屬鈉干燥重蒸后使用。所有試劑均為分析純。

Agilent 400MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標. DMSO為溶劑，TMS為內標)。

1.2 實驗步驟

1.2.1 化合物2的合成

在Ar保護下，將腺苷1(10.0 g)、DMF(40 mL)、咪唑(22.0 g)、叔丁基二甲基氯硅烷(50.0 g)依次加入100 mL圓底瓶中，在40℃下攪拌反應13h后停止反應,冷卻至室溫，加入二氯甲烷萃取(40 mL×3)，有機層依次用飽和NaHCO3(20 mL×3)、H2O(20 mL×3)飽和NaCl(20 mL×1)洗滌，無水NaSO4干燥，減壓回收溶劑，經柱層析得淡黃色油狀液體化合物2[14]。收率：88% ESI-MS m/z[M+H]+：610.27。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 8.33(s,1H),8.08(s,1H),6.00(d,J=5.2Hz,1H),4.71(t,J=4.7 Hz,1H),4.33(t,J=4.0 Hz,1H),4.11(dd,J=7.0,3.6 Hz,1H),4.03(dd,J=11.3,4.3 Hz,1H),3.77(dd,J=11.3,2.9 Hz,1H),1.01 (s,9H),0.94 (s,9H),0.92(s,9H),0.13(s,3H),0.12(s,1H),0.10(s,3H),0.09(s,3H),0.07(s,3H), -0.21(s,3H)。

1.2.3 化合物3的合成

將化合物2(10.0 g)、CH3COOH(80%,100 mL)加入200 mL圓底瓶中，回流反應5h后,停止反應，加入飽和NaOH調節pH值=8，用乙酸乙酯萃取(80 mL×3)，合并有機相，依次用H2O(100 mL×3)，飽和NaCl(50 mL×1)洗滌，無水NaSO4干燥，減壓回收溶劑，經柱層析得白色固體3[14]。收率：36% ESI-MS m/z [M+H]+：496.17。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 8.31(s, 1H),8.12(s,1H),5.84(d,J=7.2 Hz,1H),4.89(dd,J=7.2,4.5Hz,1H),4.32(d,J=4.4 Hz,1H),4.16(s,1H),3.95(dd,J=12.9,1.6 Hz,1H),3.72(d,J=11.7 Hz,1H),0.93(s,9H),0.75(s,9H),0.10(d,J=2.9 Hz,6H),-0.11(s,3H),-0.52(s,3H)。

1.2.3 化合物4的合成

在Ar保護下，將化合物3(4.0 g)、(100 mL)加入250 mL圓底燒瓶中，0 ℃下分批加入NaH，隨后滴加氨基磺酰氯的乙二醇二甲醚溶液，滴畢，0 ℃下攪拌10 min后，在室溫條件下反應17 h，停止反應，用飽和NaHCO3(100 mL×3)洗滌，乙酸乙酯萃取(100 mL×3)，合并有機相，用飽和NaCl(50 mL×1)洗滌，無水NaSO4干燥，減壓回收溶劑，經柱色譜得白色固體化合物4[14]。收率：61% ESI-MS m/z [M+H]+：575.33。1HNMR(400 MHz,DMSO)δ 8.42(s,1H),8.21(s,1H),6.01(d,J=6.5 Hz,1H),5.06～4.98(m,1H),4.46(d,J=11.3 Hz, 2H),4.37(dd,J=10.7,5.6 Hz,1H),4.31(s,1H),4.23(s,1H),0.98(s,9H),0.76(s,9H),0.20(s, 3H),0.17(s,3H),-0.03(s,3H),-0.33(s,3H)。

1.2.4 化合物5的合成

在Ar保護下，稱取石膽酸(8.0 g)、羰基二咪唑(4.0 g)、重蒸THF(70 mL)于圓底燒瓶中，60 ℃下活化2.5 h后停止加熱，移至室溫，再將化合物4(4.0 g)、DBU(1.6 g)溶于重蒸THF(90 mL)中，滴加入反應液中，滴畢繼續室溫反應8 h，減壓回收THF，加入CH2Cl2(100 mL)，H2O(50 mL×3)洗滌，水層加入2 mol/L HCl(50 mL)再用CH2Cl2(50 mL×3)萃取，合并有機相，用飽和NaCl(50 mL×1)洗滌，無水NaSO4干燥，減壓回收溶劑，經柱色譜得白色固體化合物5. 收率：75% ESI-MS m/z [M+H]+：933.71。1H NMR(400 MHz,DMSO)δ8.48(s,1H),8.14(s,1H),5.95(d,J=7.1 Hz,1H),4.89(d,J=14.6 Hz,1H),4.44(d,J=15.9 Hz,1H),4.38～4.30(m,2H),4.09(d,J=20.2 Hz,2H)。13C NMR(101 MHz,DMSO)δ178.6,175.4,156.4,153.0,150.2,139.9,119.2,86.5,84.6,75.1,73.8,70.3,67.2,56.5,56.1,42.7,42.0,40.8,40.4,36.7,35.8,35.6,35.4,34.6,30.8,28.2,27.3,26.6,26.2,25.9,24.3,23.7,20.8,18.7,18.2,17.8,12.3。

1.2.5 化合物6的合成

將化合物5(3.0 g)、重蒸THF(20 mL)、四丁基氟化銨三水化合物(5.0 g)加入圓底燒瓶中，室溫條件下攪拌8 h，停止反應，減壓回收THF，加入CH2Cl2(50 mL),依次用水(50 mL×3)，飽和NaCl(50 mL×1)洗滌，無水NaSO4干燥，減壓回收溶劑，經柱色譜得白色固體化合物6[15]。收率：60% ESI-MS m/z [M+H]+：705.20。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.05(s,1H),7.48(s,1H),6.09(s,1H),4.73(s,2H),4.36(d,J=6.5 Hz,1H),3.69～3.57(m,3H),3.44(s,1H),2.99～2.90(m,2H)。13C NMR(101 MHz,CDCl3)δ 140.1,136.7,110.0,71.8,58.7,56.4,56.1,52.2,51.6,42.7,42.1,40.4,40.1,36.4,35.8,35.7,35.5,35.3,34.5,30.5,28.2,27.2,26.4,25.6,24.2,24.0,23.4,20.8,20.3,19.7,18.4,13.7,12.0,1.0。

2 結果與討論

2.1 化合物3的合成

在化合物2的脫保護反應中，最初用乙酸在0 ℃條件下脫去硅基保護基，但是由于溫度難以控制，導致反應的穩定性較差。因此改用三氟乙酸在100 ℃條件下脫去硅基保護基，最終得到化合物3。

2.2 化合物4的合成

在化合物3與氨基磺酰基反應時，考察了溶劑對反應的影響。當以甲苯作溶劑時，原料溶解性差，副產物多，難以分離。而以乙二醇二甲醚作為溶劑時，原料溶解性好，且后處理簡單，最終得到化合物4。

2.3 化合物5的合成

在合成化合物5時，通過查閱文獻，最初嘗試將化合物4和石膽酸在DME，NaH的作用下反應，發現沒有產物生成，推測石膽酸的活性不夠，故先用羰基二咪唑活化石膽酸，再加入化合物4，在DBU的作用下最終生成化合物5。

2.4 化合物6的合成

在化合物6的合成過程中，用氟化銨脫去化合物5上的硅基保護基，發現氟化銨活性較差，難以將脫去化合物5上的硅基保護基. 然后，我們以四丁基氟化銨三水化合物作為脫硅基試劑，最終得到化合物6。

3 結論

本文開發了石膽酸腺苷的合成路線，以腺苷作為起始原料，經五步合成石膽酸腺苷，總收率為9%。關鍵中間體經過氫譜，碳譜，質譜鑒定。其藥理性質有待下一步驗證。

[1] MARQUEZ V E,EZZITOUNI A,RUSS P,et al.HIV-1 reverse transcriptase can discriminate between two conformationally locked carbocyclic AZT triphosphate analogues[J].Journal of the American Chemical Society,1998,120(12)：2780-2789.

[2] BORTHWICK A D,BIGGADIKE K.Synthesis of chiral carbocyclic nucleosides[J].Tetrahedron,1992,48(4):571-623.

[3] Liu S Y,Hua W Y,XuY G,et al.Advances in research of drugs against chronic hepatitis B: nucleoside/nucleotide analogues[J].Progress in Pharmaceutical Sciences,2005,29(5):212-218.

[4] 王冬梅,劉曉輝,郭 輝，等.腺苷類似物的設計、合成及活性研究[J].藥學學報，2013(6):881-886.

[5] DRURYA N,SZENT-GYORGYI A.The physiological activity of adenine compounds with especial reference to their action upon the mammalian heart[J].Journal of physiology，1929,68(3):213-237.

[6] SILINSKY E M.On the calcium receptor that mediates depolarization - secretion coupling at cholinergic motor nerve terminals[J].British Journal of Pharmacology,1981,73(2):413-429.

[7] VINCE R，HUA M.Synthesis and anti-HIV activity of carbocyclic 2',3'-didehydro 2',3'-dideoxy 2,6-disubstituted purine nucleosides[J].Journal of Medicinal Chemistry,1990,33(1):17-21.

[8] 關燕林.單磷酸阿糖腺苷不良反應的觀察與護理[J].藥物不良反應雜志,2000,4:243-244.

[9] DE MAN RA,MARCELLIN P,HABAL F,et al.A randomized,placebo-controlled study to evaluate the efficacy of 12-month famciclovir treatment in patients with chronic hepatitis Be antigen-positive hepatitis B[J].Hepatology,2000,32(2):413-417.

[10] 沈 龍,彭 晉.阿德福韋酯與拉米夫定抗乙型肝炎病毒作用比較[J]. 臨床薈萃, 2005, 20(4):235-237.

[11] BONG H,JIN H K,HEUNG B J,et al.A new efficient and practical synthesis of 2-deoxy-L-ribose[J].Tetrahedron,2005,61(8):4341-4346.

[12] MIZUSHINA Y,KASAI N,MIURA K，et al.Structural relationship lithocholic acid derivatives building to the N-terminal 8-kDa Domain of DNA polymerase beta[J].Biochemistry,2004, 43(33):10669-10677.

[13] GOLDBERG A A,BEACH A,DAVIES G F,et al.lithocholic bile acid selectively kills neuroblastoma cells,while sparing normal neuronal cells[J].Oncotarget,2011,2(10):761-782.

[14] FERRERAS J A,RYU J S,DI L F.Small-molecule inhibition of siderophore biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis and Yersinia pestis[J].Nature Chemical Biology,2005,1(1):29-32.

[15] RIML C,MICURA R.Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA[J].Synthesis,2016,48(8):1108-1116.