牛肉玻璃化凍藏溫度對肉品質的影響

董歡，楊菊梅，王松磊,何智武,KAZUHIRO NAKANO, 王莉，馬瑩,賀曉光*

1(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川，750021)2(寧夏尚農生物科技產業發展有限公司，寧夏 固原，756000) 3(Graduate School of Science and Technology, Niigata University, Niigata, 950-2181)

牛肉銷量大，蛋白質、礦物質含量高，脂肪、膽固醇低，含有人類生命活動中必需氨基酸，是一種營養價值高的保健型肉類食品[1-2]。隨著人們生活水平的提高，對肉制品品質提出了更高要求[3]。貯藏方式對牛肉品質有很大影響。目前關于牛肉貯藏，袁先群等[4]采用0～4 ℃、7～11 ℃兩個貯藏溫度研究黑牛肉品質變化規律；李靜等[5]研究不同真空冷卻方式對醬牛肉品質的影響；馮憲超等[6]研究了快速冷凍工藝對牛肉品質和組織的結構的影響。由此可知低溫貯藏是最為實用的一種方法，在此過程中，與分子流動性相關的質量特性如微生物、質構、營養物質、化學反應及貨架期等在很大程度上與玻璃化轉變溫度有關。玻璃化轉變是指非晶態聚合物(包括晶態聚合物的非晶態部分)從玻璃態到橡膠態或橡膠態到玻璃態的轉變，其特征溫度稱為玻璃化轉變溫度[7]。根據玻璃化轉變溫度理論，相關學者認為，食品玻璃化保藏可最大限度的保證其色、香、味、營養物質穩定。食品貯藏溫度T≤Tg時，體系處于玻璃態，分子流動性降低、黏度較高，此時穩定性最強。T≥Tg時，分子流動性增大，容易發生脂肪酸敗、蛋白變性和酶促褐變等化學變化[8-10]。周國燕等[11]采用連續掃描法和分步掃描法對濃縮草莓汁進行了玻璃化轉變溫度進行了測量。蔡長河等[12]采用差示掃描量熱法對經冷凍干燥的處理后的半干型荔枝干進行了玻璃化轉變溫度的測量。石啟龍等[13]采用了差示掃描量熱法測定了真空干燥雪蓮果粉的玻璃化轉變溫度。段人鈺等[14]利用差示掃面量熱法對包子餡(雞肉)的玻璃化轉化溫度進行了測量并預測了貨架期。目前，大多數關于牛肉冷凍貯藏品質的研究局限于單一成分、理論上的研究，并且牛肉水分含量大，成分復雜，Tg的測定比較困難，玻璃態貯藏研究較少。

本實驗以牛肉為研究對象，基于玻璃化轉變理論，采用Q-20型差示掃描量熱儀(DSC)測定玻璃態轉變溫度(Tg)，結合冷凍貯藏過程中的微生物、理化指標等綜合研究牛肉的冷凍貯藏品質變化，為今后牛肉玻璃化轉變研究提供理論依據[15]。實驗在Tg左右貯藏7個月，每隔1個月測定微生物、嫩度、揮發性鹽基氮、顏色參數，分析各指標變化規律，探討不同溫度和時間對牛肉品質的影響，以尋求牛肉最佳貯藏條件。

1 材料與設備

1.1 實驗材料

新鮮牛后腿肉,寧夏吳忠市澇河橋清真肉食品有限公司；平板計數瓊脂培養基(分析純)，山東浩中化工科技有限公司；0.9%無菌生理鹽水(分析純)，北京惠保聯化科技有限公司；氧化鎂混懸液、硼酸吸收液(分析純)，濟寧宏明化學試劑有限公司；0.01 mol/L鹽酸標準滴定溶液(分析純)，石家莊鑫隆威化工有限公司；甲基紅-乙醇指示劑、次甲基藍指示劑(分析純)，廈門海標科技有限公司。

1.2 主要設備

Q-20型差示掃描量熱儀(DSC)，美國TA公司；DC-P3色差計，北京市興光測色儀器公司；pHS-3c pH計，北京市興光測色儀器公司；TA-XT plus質構儀(刀具HDP-BSW)，英國Stable Micro Systems有限公司；熱電耦測溫儀，上海飛龍儀表電器有限公司；KDY-9820凱式定氮儀，北京通潤源機電技術有限責任公司；JA3102分析天平，上海海康電子儀器廠；LDZX-40C滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；生化恒溫培養箱，上海-恒科技有限公司；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；BD/BC-268H冰箱，廣東容聲電器股份有限公司；BCD-649WE冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

采購的新鮮牛后腿肉立即進行分割處理，分割工具及相關用具經過煮燙、酒精消毒等處理，使操作間最大程度減少染菌存在。剔除樣品中可見脂肪，根據各指標所需肉樣切割，分裝于食品級自封袋中。當天對受溫度和時間影響較大的顏色參數、嫩度、微生物和玻璃態轉變溫度進行測量，隔天進行揮發性鹽基氮的測量，后期每隔1個月對各指標進行檢測。

1.3.2 玻璃態轉變溫度Tg的測定

Tg測定前，須對儀器進行溫度和靈敏度校準。稱取10～20 mg肉樣使用壓片機密封于坩堝內，放于DSC樣品池中，參比端放置空坩堝作對照。利用液氮對肉樣凍結，保護氣體為高純氮氣，氣流量50 mL/min。采用儀器自帶TA軟件分析試樣的熱流密度曲線得到初始(Tgi)、中點(Tgm)和終點(Tge)值，取中點Tgm作為最終玻璃化轉變溫度。

經預實驗確定掃描程序為：初始溫度為室溫，以20 ℃/min冷卻至-60 ℃，恒溫10 min后以10 ℃/min升溫至-20 ℃，退火30 min后以10 ℃/min降至-60 ℃，恒溫10 min后以10 ℃/min升至20 ℃。退火30 min是由于牛肉成分復雜，水分含量大，玻璃態轉變臺階不容易出現，退火溫度也就是凍結終點T’m，其值為冰晶熔融吸熱峰右邊基線與左邊基線的交點所對應的溫度。

1.3.3 顏色參數的測定

肉樣切成40 mm×40 mm×10 mm方塊，測量之前將各溫度梯度肉樣于4 ℃解凍(12±2) h取出，待中心溫度達室溫后使用色差儀進行測量，測量前須白板校正，鏡口緊貼肉面，測量并記錄L*、a*、b*數據，每個樣品重復3次取均值。

1.3.4 嫩度的測定

參照農業部行業標準—NY/T 1180—2006《肉嫩度的測定剪切力測定法》[16]，冷卻后的肉樣沿著與肌纖維平行方向切成20 mm×10 mm×10 mm肉條，不能夾帶結締組織。

1.3.5 菌落總數的測定

參照GB 47892—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》法[17]，在無菌壞境下進行操作實驗。結果以lgCFU/g(colony-forming units，CFU)表示。根據我國食品衛生標準規定，食品中細菌總數小于4.7 lgCFU/g時，為一級鮮肉，在4.7～6.7 ogCFU/g間為二級鮮肉，大于6.7 lgCFU/g時即為腐敗肉。

1.3.6 TVB-N的測定

使用GB/T5009.44—2003《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》方法[18]：半微量定氮法測量TVB-N的含量，每個樣本重復3次，同時做試劑空白實驗。根據GB2707—2005《鮮(凍)畜肉衛生標準》[19]的規定評判肉品新鮮度。一級鮮度肉品其TVB-N值≤15 mg/100 g；二級鮮度為15～25 mg/100 g；變質肉>25 mg/100 g。

1.3.7 數據處理

采用Origin 8.5軟件、Excel 2003對實驗數據進行處理，應用SPSS 17.0軟件中的ANOVA單因素方差分析和鄧肯多重比較進行差異性分析。

1.4 品質變化動力學模型的建立

TVB-N品質變化遵循一級化學反應動力學模型[20]。

A=A0exp(kt)

(1)

式中：t為貯藏時間，d；A0為食品的初始品質；A為食品貯藏t天時的品質；k為食品品質變化速率常數。

根據不同貯藏溫度和時間下的TVB-N值，求得反應速率常數k，通過k與T的Arrhenius方程，通過變型計算活化能Ea和指前因子k0。

k=k0exp(-Ea/RT)

(2)

式中：k0為指前因子；Ea為活化能(kJ/mol)； R為氣體常數8. 314 kJ/mol；T為絕對溫度(K)[21]。

2 結果與分析

2.1 牛肉玻璃化轉變溫度Tg的測定

根據DSC曲線，取中點Tgm作為最終Tg值，Tg=-14 ℃，這與AHMET AKKSE的研究結果較為接近，其Tg= -13 ℃。因為牛肉產地不同造成蛋白、脂肪和水分比例不一樣。其次，測定條件也是造成此差異的原因。目前，測定牛肉Tg的研究不充分。1989年LEVINE[22]報道牛肉Tg值>-5 ℃，BRAKE等[23]于1999年測定出牛肉Tg值為-12 ℃。李云飛等[24]于2003年測定了牛肉糜和牛肉肌動蛋白的部分玻璃化轉變溫度，得到平均轉變溫度約為-52.54 ℃。不同學者對牛肉Tg值的測定結果差異很大，其原因目前還未有一個科學解釋，有待進一步研究探討。本實驗中牛肉玻璃化轉變臺階不是很明顯，但通過儀器自帶分析軟件可以測量。圖1是本實驗DSC曲線圖。

圖1 牛肉的DSC曲線Fig.1 Typical DSC thermogram for beef

2.2 不同貯藏溫度和時間對牛肉菌落總數的影響

牛肉的腐敗變質與微生物數量有很大關系，因此，菌落總數可作為評價牛肉腐敗程度的一項重要指標。由圖2可知，隨貯藏時間的延長，菌落總數整體呈上升趨勢。在整個貯藏期間，每種貯藏溫度下牛肉的lgCFU/g都未達到6.7，說明在這幾種溫度下貯藏牛肉7個月，都未腐敗變質。-10 ℃與其余3種溫度貯藏的牛肉其菌落總數對數值在前5個月差異顯著(p<0.05)，-14 ℃在前5個月內菌落總數對數值與-18 ℃、-22 ℃無顯著差異。從微生物增長曲線可以看出，Tg或低于Tg貯藏牛肉，短期內其穩定性好，微生物數量有所下降，是因為-14、-18、-22 ℃貯藏牛肉不利于一些嗜熱菌生長。

圖2 不同貯藏溫度和時間下牛肉菌落總數的對數值Fig.2 lg(CFU/g) value of beef at different frozen temperature and period

2.3 不同貯藏溫度和時間對牛肉顏色參數的影響

2.3.1 不同貯藏溫度和時間對牛肉L*值的影響

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，-10 ℃條件下貯藏牛肉L*值在第1個月減小，與初始值23.12相比差異顯著(p<0.05)，隨后先增大再減小，貯藏6、7個月L*值與新鮮肉相比差異極顯著(p<0.01)。在-14、-18、-22 ℃條件下貯藏牛肉，其L*值均先增大后減小，最終接近初始值。

初期-10 ℃貯藏牛肉，肉表面水分損失嚴重導致光反射率降低，L*值顯著下降，后期微生物數量急劇增加，開始大量分解蛋白質，牛肉細胞和組織嚴重受損，解凍后，大量水分溢出肉面，導致L*值升高。在整個貯藏期間，Tg或低于Tg貯藏牛肉，L*值相差不大。-14、-18、-22 ℃貯藏牛肉其L*值持續增加至第四個月，開始減小，是因為貯藏初期溫度低，對細胞和組織有破壞，L*值上升，但上升幅度不大，后來隨著冰晶的和微生物數量不斷增大，L*值持續增長，后期開始下降。綜合考慮，微生物、凍結和解凍是影響L*值變化的原因。MUELA等[25]研究凍藏對羊肉色度的影響與本研究結果相似。

圖3 不同貯藏溫度和時間下牛肉L*值Fig.3 L* value of beef at different frozen temperature and period

2.3.2 不同貯藏溫度和時間對牛肉a*值的影響

由圖4可知，-10 ℃時a*值隨時間的延長明顯降低，差異極顯著(p<0.01)。-14、-18、-22 ℃條件下貯藏，a*值在第1個月增大，與初始值10.94相比差異性顯著(p<0.05)，隨后降低，在第5個月，4種貯藏溫度下的a*值與初始值相比差異性均為極顯著(p<0.01)。-10 ℃貯藏牛肉其a*值與其余3種溫度的a*值相比差異極顯著(p<0.01)。

肉品貯藏過程中高鐵肌紅蛋白的積累是導致肉品發生褐變的主要原因[26]。-10 ℃時，隨著貯藏時間的延長，水分損失嚴重，微生物數量持續增大，pH值升高，脂肪氧化程度加劇，促進了高鐵肌紅蛋白的積累，使得a*值持續降低。在Tg或低于Tg下貯藏，a*值在第1個月增大，原因是由于凍結對肌肉細胞和組織造成損傷，肌肉表面水分較多，減小了蛋白和氧氣接觸的概率；隨著貯藏時間的延長，水分升華，氧合肌紅蛋白進一步氧化為高鐵肌紅蛋白，這是a*值減小的原因。VIEIRA等[27]在牛肉的凍藏實驗中指出，a*值隨貯藏時間的延長而減小，與本實驗結果吻合。

圖4 不同貯藏溫度和時間下牛肉a*值Fig.4 a* value of beef at different frozen temperature and period

2.3.3 不同貯藏溫度和時間對牛肉b*值的影響

由圖5可知，b*值隨貯藏時間的延長增大，說明肉品貯藏過程中發生了脂肪氧化[28]。從第2個月開始，b*值與初始值3.32相比差異性顯著(p<0.05)。隨貯藏溫度的上升，貯藏3～5個月，-10 ℃與其余3種溫度貯藏的b*值間差異性顯著(p<0.05)；6～7個月，-10℃與-14 ℃貯藏的b*值間無顯著性差異(p>0.05)，與-18 ℃、-22 ℃貯藏的b*值間差異性顯著(p<0.05)。

-10 ℃下貯藏牛肉其b*值隨貯藏時間的延長增長速度明顯大于其余3種溫度，說明脂肪氧化速度快，肉品貯藏穩定性差。原因是貯藏溫度高于Tg體系處于橡膠態或黏流態，物質的自由體積增大，黏度下降，脂質氧化、蛋白質變性、酶促褐變等受擴散控制的各種反應速率增大，物質劣變速度和程度加大。但在第5個月，-14 ℃貯藏的b*值明顯增大，與-18 ℃、-22 ℃貯藏的b*值差異顯著，說明牛肉在Tg貯藏，前期穩定性好于后期。

圖5 不同貯藏溫度和時間下牛肉b*值Fig.5 b* value of beef at different frozen temperature and period

2.4 不同貯藏溫度和時間對牛肉嫩度的影響

本實驗中牛肉的嫩度采用剪切力值表示。由圖6可知，整個貯藏期間，所有溫度下牛肉的剪切力均先增大后減小，這與BENJAKL及HALE and WATERS研究結果吻合[29-30]。4個溫度下的牛肉剪切力值在前3個月內均隨貯藏時間的延長明顯增加，與初始值6.52 kg相比差異極顯著(p<0.01)。原因是肌肉組織間形成的冰晶不斷增大，使肌纖維逐漸收縮導致牛肉剪切力增大，嫩度下降。貯藏后期，-10 ℃、-14 ℃下牛肉的剪切力值急劇下降，最終接近初始值，差異不顯著。原因是隨貯藏時間的延長，冰晶不斷增大導致肌纖維斷裂，肌肉組織結構受到嚴重損壞。整個貯藏期間，-18 ℃、-22 ℃貯藏的剪切力值間差異不顯著(p>0.05)，且溫度越低，肉品剪切力值變化程度越小。由此可以得出，當以嫩度為指標評價牛肉貯藏品質時，Tg以下貯藏牛肉其嫩度穩定性最好。

圖6 不同貯藏溫度和時間下牛肉剪切力值Fig.6 the cutting force of beef at different frozen temperature and period

2.5 不同貯藏溫度和時間對牛肉TVB-N的影響

TVB-N是衡量肉品新鮮度和腐敗程度的重要指標。由圖7可知，各溫度下牛肉的TVB-N值隨貯藏時間的延長逐漸增加。在-10 ℃貯藏1個月后其TNB-N值與新鮮肉相比差異極顯著(p<0.01)；在Tg或低于Tg貯藏，TVB-N值在第2個月開始明顯增加，差異極顯著(p<0.01)。-10 ℃與-14、-18、-22 ℃的TVB-N值在前5個月內差異性顯著(p<0.05)，5個月以后，-14 ℃貯藏牛肉其TVB-N隨貯藏時間的延長增加幅度上升，與-18 ℃、-22 ℃的TVB-N值相比差異顯著(p<0.05)，與-10 ℃的TVB-N值相比差異不顯著(p>0.05)。牛肉在-10 ℃貯藏4個月，從一級鮮度肉變為二級鮮度；在-14、-18、-22 ℃貯藏6個月變為二級鮮度。由此可以得出在Tg或低于Tg貯藏牛肉其穩定性均較好，也能有效抑制蛋白質變性，脂肪酸敗，減緩新鮮肉腐敗速率，延長貨架期。

圖7 不同貯藏溫度和時間下牛肉TVB-N值Fig.7 TVB-N value of beef at different frozen temperature and period

2.6 品質變化動力學模型的分析

根據方程(1)變型得到lnA=kt+lnA0，以TVB-N的對數值為縱坐標，貯藏時間t為橫坐標，得到圖8，斜率為反應速率常數。R2大則說明數據間線性關系好。從圖中可以看到，反應速率常數隨貯藏溫度的降低而減小。

-10、-14、-18、-22 ℃溫度下的斜率分別為0.005 3、0.005 1、0.004 7、0.004 7，斜率間差別很小，說明低溫下貯藏牛肉對反應速率常數影響不大。將方程(2)轉化成對數模型即為lnk=(-Ea/RT)+lnk0，以lnk對1/T作圖，斜率為-Ea/R，截距為lnk0，得到如圖9的結果，Ea值為0.2 kJ/mol，指前因子k0為0.004 2，建立牛肉貯藏期間TVB-N品質變化的Arrhenius方程：k=0.004 2exp(-0.2/RT)。利用此模型根據方程(1)，當確定貯藏溫度時，根據各指標的初始值和終點值即可推算出牛肉理論上的貯藏時間。

國家規定，凍豬肉冷藏安全期為7～10個月，凍牛羊肉為8～10個月，凍禽肉為6～8個月。本實驗進行了貯藏期為7個月的實驗，因此可根據貯藏第7個月時TVB-N的終點值對理論貯藏值和實測值進行對比研究。

圖8 不同貯藏溫度下TVB-N隨時間變化的線性規律Fig.8 the color changing with time under different storage temperature linear rule

圖9 TVB-N的阿倫尼烏斯曲線Fig.9 Arrhenius curve of TVB-N change

貯藏溫度/℃終點值理論貨架期/d實測貨架期/d相對誤差/%-1019．89250．021019．05-1419．57247．621017．90-1816．77209．52100．24-2216．65209．52100．24

由表1可知：-10 ℃、-14 ℃貯藏條件下，牛肉的實測貨架期均小于理論貨架期，而-18 ℃、-22 ℃貯藏牛肉其實測貨架期和理論貨架期差異小，相對誤差僅為0.24%。說明玻璃化溫度以下貯藏牛肉肉品穩定性更好。在牛肉的玻璃化轉變溫度點-14 ℃貯藏牛肉，后期肉品質穩定性差。

3 結論

通過DSC測量出生鮮牛肉玻璃化轉變溫度Tg值為-14 ℃，在等于和低于此溫度下對牛肉進行冷凍貯藏其各項檢測指標及穩定性較好。L*值在整個貯藏期間變化不大，較穩定，a*值在貯藏初期增大，后期減小；b*值隨貯藏時間的延長而逐漸增大；整個貯藏期間，隨著時間的延長，各個溫度下剪切力均先增大后減小，說明嫩度先增大后減小；菌落總數整體呈上升趨勢，TVB-N值也逐漸增加，但均未腐敗變質。對牛肉品質(TVB-N)變化的動力學模型分析：各溫度下牛肉的理論貯藏天數分別為250、248、210、210 d，與實測值210 d相比，-18 ℃、-22 ℃溫度下貯藏牛肉肉品穩定性更好。綜合上述各項實驗檢測結論可知，牛肉如果貯藏期在5個月以內，建議貯藏溫度為-14 ℃，大于5個月，從牛肉品質和生產成本角度建議貯藏溫度為-18 ℃較為理想。同時也證明，食品的貯藏溫度T≤Tg時，體系處于玻璃態，此時穩定性最強，在Tg貯藏牛肉，貯藏前期穩定性較好。在-18 ℃與-22 ℃溫度下貯藏牛肉，品質差別不大。

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