生物芯片在微生物檢測中的應用

馬新秀，胡文忠，馮可，司琦2,

1(大連工業大學 食品學院，遼寧 大連，116600) 2(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連，116600) 3(生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連，116600)

生物芯片(biochip)是20世紀90年代初出現的一種高通量、并行分析的微量分析技術[1]。它構建在玻璃片、硅片、塑料片、尼龍膜或凝膠等載體材料上，表面上固定了不同的生物分子(如：寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、多肽、抗原、抗體等)，形成可與目的靶分子互相作用和反應的固相表面。將芯片與待檢靶生物分子進行化學反應(如雜交、免疫反應等)[2]，然后利用相應的檢測手段進行信號的收集，得出檢測結果[3]。

生物芯片主要特點有：(1)高通量：采用原位合成法或直接點樣法將探針排列在濾膜、硅片、玻璃等介質上形成微矩陣，待檢樣品用同位素或熒光分子標記后，與芯片雜交，通過掃描及計算機分析即可獲得樣品中大量的基因序列及表達信息，以達到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的；(2)高靈敏度：芯片檢測結果的敏感性為96.2%，每種病毒檢測的最低量為10 copies/μL，使生物芯片具有較的高靈敏度；(3)高特異性：芯片在雜交反應完畢后進行洗脫，使不與靶標結合或非特異性結合的部分洗脫掉，芯片檢測結果的特異性為99.3%。在生物大分子功能研究、食品安全檢測、病原微生物檢測和鑒定等方面發揮著越來越重要的作用。

1 生物芯片技術的研究進展

生物芯片是指采用微量點樣或光導原位合成等方法，將大量核酸片段、抗原、抗體、多肽分子等生物樣品有序地固化于支持物(玻片、玻璃片、硅片等)表面，形成密集的二維分子排列形式，一般生物芯片只會采用一種類型的探針，即用核酸或抗體作為探針，然后與已標記的待測生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器如電荷偶聯攝影像機(CCD)或激光共聚焦掃描儀對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的種類和數量[4]。

生物芯片根據其構造不同可分為陣列型芯片、微流控芯片、納米芯片等[5]；根據其分析的探針不同可分為基因芯片、糖芯片、蛋白芯片、細胞芯片、組織芯片等[6]；根據其應用不同可分為表達譜芯片、診斷芯片、檢測芯片、基因組SNP分析芯片、基因組染色體變異分析芯片以及藥物分析芯片等。各種芯片各有特點，但都具有高通量、高特異性和高效的共性。

1.1 微陣列芯片

微陣列芯片主要包括基因芯片、蛋白質芯片和細胞芯片等生物芯片，是將數十甚至數萬種生物探針分子以陣列的形式固定在厘米級別的固體載體上，利用生物分子間的相互作用，與樣品中的靶分子結合，通過熒光、同位素放射顯影、酶標顯色及化學發光來顯示出每個位點的復雜信息[7-8]。WANG等[9]設計了一個微陣列芯片，對PCR產物進行分析。對80個季節性流感病毒的臨床樣本進行檢測，其中有66個陽性樣本，檢測的特異性和敏感性分別為95.5%和100%，認為微陣列芯片具有快速，可靠，價格低廉的檢測方法。ALEXANDER等[10]設計了一種高度并行的微生物檢測的寡核苷酸芯片，對多種微生物在單一芯片中高通量的并行檢測，結果顯示，10～30個樣本可以在24 h內得到可靠的分析，適合于檢測大規?；虮磉_等的研究，及微生物的定性分析?；谶@種快速、高效的特點，微陣列生物芯片在生物學和醫學等領域獲得了廣泛應用，包括測定基因或蛋白質表達圖譜、研究特定的基因或蛋白質功能、研究分子間交互作用、尋找疾病的生物學標記、微生物鑒別以及微生物族群分析等。

1.2 微流控芯片

微流控芯片的最大優點是在微小的空間內對樣品進行預處理、反應或分析的過程，從而達到集成的功能[11]。在固體基片上構建微流道、微泵、微閥、反應器、混合器、過濾器、分離器等微小裝置，實現生物樣品的制備、生物化學反應、液相色譜分析、PCR反應、電泳檢測等操作。它的目標是將整個實驗室的功能，包括采樣、稀釋、加試劑、反應、分離、檢測等集成在微芯片上[12]。微流控芯片可以用來反應或分析，在生物技術中是一個非常重要的技術，可實現成為微型化實驗室的設想，只需將待測樣品直接加入到芯片中，芯片便會自動執行復雜的實驗流程，同時，多個樣品或者多個反應可在同一芯片同時處理，并且可以迅速得到結果[13-14]。LIN等[15]設計了一個微流控芯片，對蛋白質進行高通量和快速的分析，穩定性較高，是一種一體化、小型化、易于自動化的檢測分析裝置。微流控系統的特點主要表現在高通量、低劑量、快速分析且具有便捷性等方面，現已應用于DNA分析，免疫分析和細胞分析。微流控芯片可以用于快速分析微生物的生物學特征，對微生物的檢測有著十分重要的意義。

1.3 納米芯片

近年來，貴金屬納米粒子由于其獨特的光學特性，成為傳感器優化傳感的關鍵元件，具有高靈敏度、高效和無標記檢測等特性。這樣的傳感器能夠同時檢測和分析大量的樣品或單一樣品中的多個分析物。納米粒子固定在傳感器芯片表面上，通過物理屏障形成不同的區域，用于并行檢測，這些孤立的檢測區域在一定程度上實現了高通量檢測[16]。

通過病原體或病原體分泌的毒素與活性物質同傳感器上的受體結合，納米粒子用于傳感器中，根據顏色變化來進行檢測。希迪安等在2007年制作了一個以玻璃支撐的聚二乙炔(PDA)為基礎，由細菌分泌的誘導增殖的兩親分子在PDA基質上引起顏色改變的比色傳感器，能夠對細菌進行檢測[17]。

新興的納米技術具有復用能力以及無酶的操作能力。納米材料具有獨特的化學和物理性能能夠適用于醫學檢測，如具有良好的生物相容性，高的表面積與體積比，與散裝材料相比，具有獨特的光學特性。最近幾年，用納米金識別和結合DNA，并用電化學方法來監測的工具逐漸增加，這種方法可以通過測定氯化物在納米探針的表面固定化的氧化還原電位的變化確定靶DNA的濃度，同時，硫化鉛納米粒子被作為寡核苷酸的標記來進行電化學的檢測。這種電化學檢測的范圍在10-11～10-12[18]，可見納米生物芯片具有較高的檢測靈敏度。

2 生物芯片檢測微生物

2.1 微陣列芯片在微生物檢測中的應用

MARINA等[19]利用共聚物吸附的方法在芯片表面用聚二甲基硅氧烷涂層，通過共聚物涂層的聚二甲基硅氧烷的芯片，同共價結合氨基修飾的DNA片段結合，應用于細菌基因分型實驗。這種共聚涂層的聚二甲基硅氧烷的芯片可作為半自動的DNA微陣列芯片來快速檢測食品中的病原菌。這種涂膜的芯片既因微陣列而具有高通量，可以同時檢測多種菌，又因聚二甲基硅氧烷使芯片具有最佳的特異性和靈敏度。對芯片的修涂層修飾可提高芯片的靈敏度和特異性，但探針的設計也十分重要，如SEUNG等[20]利用23 SrDNA和16 S-23 SrDNA基因間隔區(ISR)進行探針的設計，因為在23 SrDNA和16 S-23 SrDNAISR中既有保守區又有特異性的區域。并且利用這樣的探針，設計出了微陣列芯片，應用于39種致病菌的檢測，這種微陣列芯片檢測的檢出限在10～103CFU/mL，能夠應用于多種致病菌的檢測。微陣列芯片檢測快速，可以對樣品中的多種菌進行檢測，如YU等[21]用微點樣的方法結合多重PCR設計出微陣列芯片。對五種沙門氏菌進行檢測，并在雞肉樣品進行檢測，將雞肉樣品打成勻漿后，利用芯片檢測，檢出限可達102CFU/mL，這種生物芯片能同時對這五種沙門氏菌中的任何一種進行定性分析。并且可以利用這種芯片來檢測家禽及家禽產品的沙門氏菌感染情況，而且同時適用于其他食品樣品的沙門氏菌檢測。微陣列芯片不僅加快了樣品檢測的速度，同時提高了檢測的靈敏度，MARISA等[22]將微陣列芯片應用于純培養參考菌株和家禽肉樣本中彎曲桿菌的檢測，得到生物芯片在檢測中的靈敏度，同標準的實驗室方法進行比對，如PCR、平板計數和斑點雜交等。體現出微陣列芯片在家禽肉檢測中快速簡單可靠的特性，不同濃度的彎曲桿菌純培養的生物芯片檢測，得出的結果顯示出良好的線性關系，這種檢測彎曲桿菌的微陣列芯片比經典平板法和分子法要敏感20倍，而且使用更加方便，穩定性也更好。微陣列芯片上密集著大量的探針，可以對微生物進行高通量的檢測，大大節省了檢測的時間。但是芯片的建立繁瑣，需要技術人員的指導，因此，芯片的簡易制作和推廣成為了其今后發展的方向。

2.2 微流控芯片在微生物檢測中的應用

ZHE等[23]設計了一個微流控芯片來檢測細菌DNA。芯片是由聚二甲基硅氧烷(PDMS)來制備的，它包括固相萃取(SPE)室，兩個獨立的通道和多回路介導等溫擴增(LAMP)室。3株細菌(大腸桿菌O157:H7，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌)被用來測試該設備的可行性。多環介導等溫擴增的產量直接由紫外光檢測，并由瓊脂糖凝膠電泳證實。使用這種芯片，成功地在2 h之內檢測出了這3種菌，3種菌的檢出限小于102CFU/100μL。但該芯片還需其他的設備來證實結果，實時在線檢測更能縮短檢測時間，WANG等[24]將通過CdSe/ZnS量子點標記的鼠傷寒沙門氏菌，在一個多通道的微流控芯片系統中，由發光二極管進行熒光檢測，由CdSe/ZnS作為熒光標記點，提高了檢測的靈敏度。這種微流控芯片由12個樣品通道，3個混合區和6個免疫反應區組成，利用免疫反應，通過熒光檢測，檢出限在37 CFU/mL。這種在線標記的原位熒光檢測的多通道微流控芯片已經成功應用于豬肉樣品中的鼠傷寒沙門氏菌的檢測。微流控芯片可以作為一種微型實驗室對微生物進行檢測，如RAFAL等[25]利用微流控芯片對多種病原菌進行檢測。通過微流控芯片進行DNA/RNA的提取，實時熒光PCR的檢測，將微流控芯片設計成一個小型的可移動的實驗室。這種芯片具應用了新的光學檢測方法。微腔的設計以及多個微腔，滿足多個樣品同時檢測，具有高效，節省樣品，便攜等特點，并且成功的應用在檢測沙門氏菌，霍亂弧菌等致病菌當中。微流控芯片不僅便攜，而且檢測的靈敏度也較高，如HSU等[26]設計的芯片應用于生物樣品的DNA雜交實驗，應用DNA特異性探針雜交技術檢測病原菌。根據堿基互補配對原則，可將已知的單鏈作為“DNA探針”，然后同其他未知DNA序列的溶液混合可通過DNA探針判斷是否存在互補DNA片段，利用熒光標記的方法，在532 nm的綠光下，檢測生物樣品的存在，靈敏度要比傳統比色法高1 000～500 000倍，這是一種更加靈敏、快捷、準確的檢測方法。微流控芯片具有便捷，高效，高通量等特點，但是微流控芯片由于集成的功能，微型化的程度不如其它芯片，因此更微小的芯片可作為今后微流控芯片研究的方向。

2.3 納米芯片在微生物檢測中的應用

BHAWANA等[27]將聚苯胺納米粒子固定在瓊脂糖凝膠上，形成一個生物芯片，用其對細菌進行實時監測，通過明顯的顏色變化(從藍色到綠色)來顯示結果。由于沒有特定的抗體或受體的使用，這種芯片可以檢測任何細菌生長?？梢詰糜谑称分懈瘮∥⑸锏臋z測。還可以利用銀-對苯二酚溶液來增強檢測效果，CHIA-HSIEN等[28]介紹了一種細菌光學生物芯片基礎上開發的DNA雜交檢測方法。將鮑曼不動桿菌作為DNA樣本的來源，用生物素標記的引物PCR擴增細菌DNA，以及用金-鏈霉親和素納米粒子和銀-對苯二酚溶液來增強檢測。由于金納米粒子利用對苯二酚催化銀制金屬的銀離子。逐漸沉淀的銀離子導致光學檢測信號的差異，通過肉眼或光學儀器(如平板掃描儀)很容易地觀察到。銀染的的方法應用于納米芯片，使檢測結果更易觀察，如劉和平[29]建立了一種簡單、快速的比色芯片判斷PCR產物存在與否的方法。用鏈霉親和素-納米金結合銀染的方法鑒定4種不同大腸桿菌血清型。結果表明，納米金比色芯片檢測結果與瓊脂糖凝膠電泳的結果一致，芯片雜交的納米金標記與熒光標記檢測的結果相當，這個實驗合成了7對引物，優化了七重PCR反應體系和反應條件，該實驗可直接用肉眼觀察檢測結果，可以用來檢測食品中的微生物。納米芯片雖然能夠用肉眼直接觀察結果，但比較耗時費工，成本較貴，因此降低納米芯片的成本能使納米芯片更廣泛地應用于微生物的檢測。

2.4 其他生物芯片在微生物檢測中的應用

酶芯片：SU等[30]提出了基于CMOS陣列光電傳感器和1×3聚合酶生物芯片對大腸埃希氏菌進行光學一步檢測。這種方法使用4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷酸(MUG)作為熒光底物，對β-葡萄糖苷酸酶(GUD)的檢出限是0.1 u/mL，約等于106CFU/mL大腸桿菌的細胞濃度。MUG以最終濃度100 μL/mL混合于月桂基蛋白胨培養基中，能夠在1×3聚合酶生物芯片中立即檢測出大腸桿菌的存在，對40株大腸桿菌進行檢測，都有較好的結果。

糖微陣列芯片(glycochip)：糖微陣列芯片是監測碳水化合物配體和其他生物大分子的分子間相互作用的現代生物技術。這種芯片具有微尺度、響應快、靈敏度高、高通量等特點。它廣泛應用于許多研究和開發領域。如WAN等[31]提出，多糖是生物信息的重要載體，在生物體中參與許多生理過程，如能量儲備、病理變化、細胞代謝、抗原抗體結合等。細菌細胞表面具有許多多糖和糖苷化合物如莢膜多糖、脂多糖和糖蛋白。利用熒光硅納米標記細菌，并用碳水化合物芯片對其進行檢測，具有較好的檢測效果。

可視化芯片：顧大勇等[32]研究建立了能同時檢測幾種腸道病原體(霍亂弧菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157:H7)的可視化快速、高效的基因芯片檢測技術。該芯片具有較好的特異性和重復性，檢測靈敏度可達25 ng/μL，芯片檢測結果與PCR方法檢測結果一致。

生物芯片樣品制作和標記方法復雜，造成生物芯片技術在食品檢測方面需要更高的成本和勞動力，簡化樣品制作，可減少成本，提高檢測效率。

3 展望

生物芯片技術在病原微生物診斷、抗藥基因、毒力基因、致病因子的檢測等方面顯示出巨大的發展潛力，現已成為新的研究熱點。不但可以應用于病原微生物的檢測，還可以用于生物毒素和病毒等的檢測。但是，該技術本身還存在一些缺陷和亟需改善的地方。如現階段的生物芯片大多還要采用熒光(Cy3和Cy5等熒光染料)標記技術[33]。芯片檢測需要激光共聚焦掃描儀這種價格昂貴的儀器設備，令使用生物芯片的成本提高。相對應出現的一種可視化芯片，不需要高昂的熒光掃描設備，只需用肉眼或借用簡單的設備便可觀察結果，既方便又降低了成本。近年來微電子技術已經滲透到人們的工作、生活以及生產活動中，成為現代化生產與現代生化的主要支柱，半導體技術作為微電子技術可用于制作生物芯片，能使生物芯片朝著更加微型化的方向發展[34]。制造微型全分析系統或微芯片實驗室也是生物芯片未來發展的趨勢。集成化使生物芯片使用起來更加方便，生物芯片也將在集成化的方向擴展。

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