多次頂空萃取-選擇離子流動管-質譜法測定食用油中呋喃的氣液分配系數

孫兆昱，黃雪松

(暨南大學 理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州，510632)

呋喃是由食品中不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、糖類、氨基酸、VC等營養成分受熱而產生的，屬于可能使人體致癌的2B類致癌物，其在咖啡、醬油、嬰兒食品等食品中含量約為100 ng/mL[1]。另外，已經證實呋喃可能是地溝油中的特征成分，可以作為鑒偽地溝油的標志性成分之一[2]。因此，為保證食品質量與安全、減少食品營養成分的損失、鑒別食用油真偽等，必須首先能夠及時、快速、準確地測定食品中的呋喃。

常溫下，由于呋喃是易于揮發的氣體(沸點31.4 ℃)，因而難以取樣和測定。美國FDA建議的方法是：采用頂空取樣、以氘代呋喃為標樣，進行氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)測定，目前測定食品中呋喃的方法都是采用該法或其改進的辦法，如固相微萃取-GC-MS[3-4]、質子轉移反應質譜(proton transfer reaction-mass spectrometry, PRT-MS) 等[5]。但使用這些方法時，其頂空取樣量容易受溫度、壓力、時間等多種因素的影響，尤其受呋喃在樣品與頂空中的分配系數影響，導致呋喃測定誤差。因此，要準確定量測定食品中的呋喃等揮發物質的含量，需首先準確測定其分配系數。2007年王振東[6]等以分子拓撲的方法來研究烷基苯、醇、醛和烴等化合物的結構與氣液分配系數的相關關系。2010年柳剛[7]等使用U型水銀壓力計測定了亞硝酸甲酯在甲醇溶劑中的分配系數。2011年王永華[8]等通過頂空氣相色譜法測定了海水中二甲基硫氣液分配系數。但未見測定食用油中呋喃等揮發性成分氣液分配系數的報道。

KOLB等報道了一種不連續氣體萃取技術[9],后被更名為多次頂空萃取(multiple headspace extraction, MHE)，其基本步驟是多次萃取頂空中的部分平衡氣體，即，在每次萃取達到平衡后測定頂空中目標揮發物的含量，之后抽除部分頂空氣體；待樣品中氣液兩相再次充分平衡后，測定頂空氣體的目標揮發物并重復抽除操作；該過程一般重復5次以上。根據每次測定的峰面積和測定次數之間的對數關系式計算出所測成分的分配系數。但未見MEH分析測定呋喃分配系數的報道。

選擇離子流動管質譜(selected ion flow tube-mass spectrometry，SIFT-MS) 是一種靈敏度高( 檢出限為10-12級) 、可以在線測定氣相中物質成分及其絕對濃度[10]的方法，其取樣方式為頂空取樣，適宜于呋喃等揮發性物質分配系數的測定。該方法已用以物體呼出氣體[9-12]、食品香味物質[13-14](如葡萄酒[11]、橄欖油[12]、蘑菇[13]、果汁[14])、食品包裝材料[15]、環境中氣體[15-16]等痕量成分分析中的快速測定。本論文報道一種基于多次頂空萃取(MHE)和選擇離子流動管質譜法(簡稱MHE-SIFT-MS)測定油中呋喃分配系數的方法。

1 材料與方法

1.1 依據MHE-SIFT-MS推導氣液分配系數方程式

1.1.1 公式推導法

根據MHE原理[9]，可推導出呋喃的分配系數K。

在恒溫封閉的氣、(油)液平衡體系內，呋喃在體系中的總質量為：

X0=G1+L1

(1)

式 (1)中：X0為體系內呋喃的總質量，G1和L1分別為第1次平衡時，呋喃在氣相和液相中的質量。

已知K被定義為兩相濃度之比(即符合亨利定律),令濃度為C0。液相中濃度為Cl，氣相中濃度為Cg，則有：

(2)

(3)

(4)

第一次抽取氣體后，再將其進行氣液平衡處理，即進行第2次平衡。當達到第2次氣液平衡后，經測定可以求得第2次平衡時氣相中質量(G2)為：

(5)

對于第n-1和第n次抽取和平衡時，則有關系式(6)和(7)

(6)

(7)

式(6)除以式(7)，可得式(8)：

(8)

(9)

式(9)即是MHE測定揮發性物質分配系數的計算公式,可以將連續2次萃取平衡后的測定值代入式(9)式，即可以計算出呋喃等揮發性或半揮發性物質在食用油等液體的液氣分配系數。

1.1.2 直接法

為比較MHE法的有效性，采用加入標樣并測定其標準曲線的辦法測定呋喃在油中的分配系數。

分別注射入空瓶體積(Vt)和另外含一定體積油(油的體積為Vl)的瓶中同樣質量的呋喃(W)，根據SIFT-MS所測的兩者氣相呋喃濃度值(空瓶測定值為Ct,裝有油的瓶測定值為Cg)即可計算呋喃在油中的分/配系數。則有如下計算分配系數K的關系式。

W=CtVt=CgVg+ClVl

(10)

(11)

(12)

Cl為液相油脂中呋喃的濃度，將W=CtVt帶入(12)式，得：

(13)

如果油樣中如含有一定量的呋喃，仍然可以注入呋喃標樣進行直接測定，即將(13)式校正為(14)式：

(14)

這里的Cg0為未加入標樣時測定的油樣氣相中的呋喃質量濃度(與加入呋喃標樣時氣相與液相體積相同)，并需要將Cg0換算成呋喃標準曲線條件下的質量濃度。

1.2 材料與試劑

呋喃(分析純，99%)購自Acros Organics公司 (USA)；澳洲堅果油為實驗室自制[12]，市售大豆油、花生油及冷榨橄欖油購自俄亥俄州立大學附近的Kroger超市。

1.3 儀器與設備

Syft Voice200選擇離子流動管質譜儀(SIFT-MS, Syft VOICE-200，Syft Ltd., Christchurch, New Zealand)，Winchester恒溫水浴鍋(280 Series Water Bath, Precision Inc., USA)，Hamilton Gastight 10 μL微量注射器(Syringe, 1800 Series 1801 RN Hamilton Co., USA)。

1.4 實驗方法

1.4.1 呋喃標準溶液配制

準確稱取100 mg呋喃溶于100 mL冷乙醚中，獲得1 g/L 呋喃溶液，吸取5 mL該溶液稀釋至 100 mL成 50 mg/L 呋喃母液備用。

用微量注射器精確吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL母液分別注入 (540±5) mL Pyrex 1395空玻璃瓶(Corning Incorporate, USA)后，將其放入50 ℃保溫平衡1 h 待測；每個質量濃度重復5次，其質量濃度平均值分別為0.092 6、0.185、0.278、0.370及0.463 ng/mL。每鍋可放入20瓶。

1.4.2 選擇適宜的平衡條件

以豆油為樣品，分別保溫平衡40、50、60、70 min，根據其頂空中的呋喃含量穩定與否而判斷是否達到呋喃氣液平衡的條件。

1.4.3 呋喃在油中K值的測定

為驗證MHE-SIFT-MS 法的正確性，分別采用直接法 [即式(9)]與MHE-SIFT-MS[式(14)] 2種方法進行測定同一處理油樣瓶頂空中的呋喃濃度。對于MHE-SIFT-MS法，當第1次測定瓶中呋喃質量濃度(該濃度用于直接法計算呋喃在油中的K)后，用注射器抽出200 mL頂空氣體，并把瓶子再放回水浴鍋中于第一次平衡時同樣的條件下保溫平衡后再行測定；同樣的方法處理5次。

1.4.4 SIFT-MS條件

Syft VOICE-200 配有v.1.4.9版軟件，采用選擇離子模式(SIM)測定，氬氣和氦氣為載氣，根據呋喃與硝基離子(NO-)的反應速率常數 (k=1.7×10-9cm3/s)，計算出所測油樣品的頂空氣體中呋喃的含量[17]。其他條件：掃描時間60 s，延遲計算時間5 s，呋喃正離子產生時間100 ms；反應離子產生時間：前體離子25 ms；微波功率：50 W；氦載氣壓力：200 kPa；加熱進口溫度：120℃; 空氣用作離子源氣體；氣體流量分別為2 L/s和3 L/s；樣品和毛細管的氣體流量分別為0.45 L/s和1.3 L/s；流動真空管壓力：5.10±0.40 Pa。測定前，按照儀器使用規程，利用公司提供的標準氣體進行精密度和精確度校驗。

1.4.5 呋喃的測定

將5.00 g油裝入(540±5) mL玻璃瓶中，用裝有Pyrex硅橡膠內襯墊(Lowell，MA，USA)的PTFE瓶蓋(Coring Incorporate, USA)旋緊后，置水浴鍋中保溫達到氣相平衡，取出，再用18號不銹鋼針頭穿透襯墊進入瓶頂空中(距油樣液面約18 cm)取氣樣進入SIFT/MS儀器中測定其呋喃濃度。為保持抽氣測定過程中的壓力平衡，插入另外一只14號16 cm長不銹鋼針頭(距油樣液面約12～15 cm)。測定完后進行下一瓶的測定。整個測定過程約2 min。

1.5 數據分析

采用Microsoft Office 2007對數據進行方差分析。顯著水平為p≤0.05. 檢出限和定量限參考JAMES FRANCIS method[18]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

所測樣品中呋喃的實際含量是評價MHE-SIFT-MS法和直接法測定得到的呋喃分配系數是否正確的依據。本論文擬根據標準曲線判斷所測數據的可靠性。對所測5個點、均重復5次的MHE-SIFT-MS測定數據整理后，得出呋喃的標準曲線是y=527.88x-6.742 4(式中，y：計算呋喃質量濃度；x：實測呋喃濃度)，R2=0.994 2>p0.05=0.95，其5個質量濃度的平均值分別是0.092 6、0.185、0.278、0.370、0.463 ng/mL，其相對標準差(RSD)分別是9.1%、4.2%、2.5%、3.49%和6.70%(n=5)，其線性范圍取0.060 0～0.37 0 ng/mL，其檢出限、定量限分別是0.046和1 ng/mL，其回收率是(528±36.5)% (n=5)，比實際含量高5.28倍。該差異可能是水的次生電離所致[6]。

2.2 MHE-SIFT-MS法測定呋喃的適宜平衡條件

在MHE-SIFT-MS測定過程中，只有確保樣品中的呋喃達到氣液兩相完全平衡、才能保證測定值正確，進而按照式(9)式獲得正確的K值。圖1顯示(540±5) mL的樣品瓶中裝有5 mL豆油時，在40、50、60、70 和80 ℃下，平衡1 h條件下所測定樣品瓶頂空中的呋喃值。

圖1 頂空中呋喃的質量濃度隨平衡溫度的變化Fig.1 Effect of equilibration temperature on the furan concentration

從圖1可以看出：60 ℃平衡1 h，頂空中呋喃的質量濃度趨于穩定，即在該條件下，樣品瓶中氣、液兩相的呋喃質量濃度已經分配平衡；只有在此時所測定的呋喃質量濃度才可以用以計算其分配系數。因此，在測定呋喃在油樣中的分配系數時，應該在60 ℃時平衡1 h后進行MHE-SIFT-MS測定。

2.3 方法驗證

由表1可以看出：在60 ℃平衡1 h后，采用MHE-SIFT-MS法[式(9)]測定的呋喃在澳洲堅果油、大豆油、花生油、橄欖油中的分配系數分別為338.5、336.4、357.6、365.6，平均為(349.5±14.3)；而采用直接法[式(14)]測定這些油中呋喃的分配系數分別為328.4、318.6、342.2、357.6，其平均值為(329.4±9.7)，二者相差20.1，相對相差為5.9%。考慮到儀器分析誤差一般為3%～6%，我們可以認為兩種方法所測得的呋喃分配系數基本一致。也就是說，MHE-SIFT-MS法[式(9)]與直接法[式(14)]測定的油中的呋喃分配系數無本質差異，因為它們的計算值基本一致(n=5)。雖然兩種方法的相對標準誤差稍有差異，但因MHE-SIFT-MS法不需要呋喃標準品即可測定，且簡單、快速，因此適用于呋喃等揮發性成分特定條件下分配系數的測定。

表1 兩種方法(公式)所測得的呋喃的分配系數及相對標準誤差(n=5, 60 ℃ 平衡1 h) Table 1 The partition coefficients and RSD of furan determined by two equations (n=5, equilibrated at 60 ℃ for 1 h)

2.4 分析

2.4.1 MEH-SIFT-MS法測定呋喃等揮發性成分分配系數的可靠性

本方法只是測定了部分食用油中呋喃的分配系數。考慮到氣體在密閉體系中的分配符合亨利定律，而式(9)是根據亨利定律推導出的，因此可以推知，與呋喃類似的其他揮發性成分的分配系數也應當符合該式。

已有許多文獻報道MHE法測定揮發性成分分配系數的報道，該方法一般是通過不同峰面積對數值的線性回歸值，進而計算出所測揮發性成分的分配系數。而MHE-SIFT-MS法可以直接測得出頂空(即氣相)的絕對濃度，減少了這種線性回歸方程的計算及其導致的誤差。另外，式(9)通過濃度比計算分配系數，可以減少或消除一些隨機誤差。表1中的RSD值較低，也間接地證實了這一點。

2.4.2 揮發性成分的分配系數的測定值是有條件的

測定呋喃等揮發性成分的分配系數受測定時的溫度、壓力與液相體系作用力，以及測定時的相比、平衡時間、擴散特征和表面積等多方面的影響，在引用這些分配系數測定值時，應當注明這些測定條件。但很多文獻報道的揮發性成分分配系數值，并未包含上述測定條件。

3 結論

通過數學求證和實驗等方法，證實MHE-SIFT-MS法可以測定封閉體系頂空中的呋喃的分配系數，該方法簡單、實用，在無揮發性氣體標樣的情況下可獲得其在特定條件下的分配系數，數學關系式可作為其他揮發性成分分配系數測定的參考。

致謝：感謝美國俄亥俄州立大學食品科學技術系Sheryl Barringer教授給予的指導。

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