加熱蒜氨酸形成活性硫產物的鑒定

黃雪松, 李星星，陳子興

(暨南大學 理工學院，食品科學與工程系, 廣東 廣州，510632)

我國是世界上最大的大蒜(AlliumsativumL.，蒜頭、胡蒜、獨蒜等)生產、消費和出口國家[1]。大蒜具有增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、降血糖、降血壓、降膽固醇[2-4]、解除蛋白酶的抑制[5]等多方面的生物活性，還有益于合成人體腎上腺素、膽堿、谷胱甘肽和牛磺酸等生理活性物質[6-7]。這些活性作用與其所含有蒜氨酸等含硫氨基酸有直接或間接的聯系。

活性硫(reactive sulfur species，RSS)是一類對人體代謝有重要作用的硫化氫、硫烷、巰基、亞砜、亞磺酸類的含硫化合物。谷胱甘肽、胱氨酸是典型的RSS化合物[8]。大蒜中的蒜氨酸，在蒜氨酸酶的作用下，可以形成大蒜素，并進而形成許多可以揮發的二烯丙基二硫和二烯丙基三硫等RSS化合物，已被視為具有多種生物活性的“活性硫”化合物，也具有多方面的生物活性。如BENAVIDES等研究表明：大蒜的血管活性作用是由二烯丙基硫化物轉化為過硫烷(hydropersulfides)類RSS物質所產生的。該過程是由二烯丙基硫與谷胱甘肽反應而產生，同時也釋放出H2S[9]。蒜氨酸在加熱條件下，也可以形成揮發性二烯丙基二硫和二烯丙基三硫等RSS化合物[10]。另外，黃雪松、周華等人還研究了蒜氨酸受熱分解產生活性硫物質的動力學參數[11]。

但對于蒜氨酸在非酶條件下，諸如黑蒜、蒜泥、糖醋蒜等加工生產過程是否形成RSS的研究未見報道。為排除原料中蒜氨酸酶等的影響，擬采用蒜氨酸純品、模擬黑蒜等加工產品的熱處理條件，再采用液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)、串聯質譜法(MS/MS)和液相色譜-高分辨質譜法(UPLC-HRMS)等方法鑒定是否形成RSS等生物活性物質，為揭示黑蒜等蒜制品的保健作用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

蒜氨酸和S-烯丙基-半胱氨酸(SAC)均為化學合成(周華提供[12]，分別與標準品對照后確定為蒜氨酸和SAC產品)，其純度為95%～98%。

冰醋酸，甲酸(分析純)，天津市富宇精細化工有限公司；乙腈、甲醇(色譜純)，美國迪馬公司；尼龍66針式過濾器(直徑13 mm，孔徑0.45 μm)、尼龍66微孔過濾膜(直徑13 mm，孔徑0.45 μm)，天津市津騰實驗設備有限公司。

恒溫水浴鍋(HH-4)，中國江蘇金壇市宏華儀器廠；超聲波清洗器(KQ-218)，昆山市超聲儀器有限公司；LC-MS的LC部分(Agilent 1100)，美國安捷倫；色譜柱型(Eclipse XDB-C18，150 mm×2.1 mm, 5 μm)，MS(AB 4000 Q TRAP)，美國生物系統公司；UPLC-HRMS的LC部分(Agilent1290)，美國安捷倫公司;色譜柱(RRHD SB-C18，2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)，質譜部分(Maxis impact)，美國布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒜氨酸的熱處理

稱取約0.75 g蒜氨酸溶于30 mL 20%的甲醇水溶液中，用鋁蓋密封后，于90 ℃恒溫水浴中加熱2 d，再冷卻后保存于-20 ℃冰箱中。用時置室溫平衡24 h，取出1 mL用針式過濾器過濾到液相進樣瓶，待HPLC的測定。

1.2.2 蒜氨酸熱分解產生活性硫產物的鑒定

(1)初步鑒定:將上述樣液經LC-MS測定并推斷產物的分子質量，并據蒜氨酸的結構特點推測所獲RSS可能的分子結構。

(2)進一步確證:在初步鑒定的基礎上，進一步利用MS/MS法和UPLC-HRMS法對蒜氨酸的熱解產生的RSS進行對比分析，從而鑒定蒜氨酸受熱分解形成的RSS產物。

1.2.3 測定條件

(1) LC-MS:液相色譜：色譜柱型(Eclipse XDB-C18，150 mm×2.1 mm, 5 μm)、不分流、在室溫下用乙腈(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫程序為：0～3 min，A為2%；3～35 min，A從2%→45%；35～40 min，A為45%；40.1～50 min，A為2%；總流速為250 μL/min，進樣量為10 μL。

三重四極桿串聯質譜儀配用電噴霧離子源，同時采用正離子模式(ESI+)和負離子模式進行檢測(ESI-)。其工作軟件為Analyst Software，檢測條件如下：離子源電壓(IS)，5 500 V；解簇電壓(DP)，60 V；離子化溫度(TEM)，500 ℃；氣簾氣(CUR)、霧化氣(GS1)和干燥氣(GS2)均為氮氣，壓強分別為20、45和40 psi；掃描質量范圍為50～1 200m/z。

(2)MS/MS:采用ESI+進行檢測，離子化溫度(TEM)為0 ℃；解簇電壓(DP)，50 V；入口電壓(EP)，10 V；碰撞能量(CE)，17 eV；碰撞室出口電壓(CXP)，4 V；簾氣(CUR)、霧化氣(GS1)和干燥氣(GS2)的壓強分別為15、35和0 psi；掃描質量范圍為30～200m/z。其他條件與2.3.3-(1)中的條件一致。

(3) UPLC-HRMS:超高效液相色譜：色譜柱型(RRHD SB-C18，2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)、不分流、在室溫下用0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動相，梯度洗脫程序為：0～1 min，B為15%；1～4 min，B從15%→85%；4～8 min，B為85%；8～9 min，B從85%→15%；9～10 min，B為15%；總流速為200 μL/min，進樣量為10 μL。

超高分辨率電噴霧-四極桿飛行時間質譜采用ESI正離子模式，工作軟件為Data Analyst 4.0，檢測條件為：毛細管電壓(capillary)，3 500 V；端板補償電壓(end plate offset)，-500 V；充電電壓(charging voltage)，2 000 V；噴霧器壓強(nebulizer)，0.2 MPa；干燥氣流速(dry gas)，8.0 L/min；干燥溫度，180 ℃；掃描質量范圍為50～1 000m/z。

1.3 數據分析

本實驗的所有樣品均設置了3個重復，用Microsoft Office Excel 2007對數據進行處理并作圖，對數據以誤差線(平均值標準差)的形式表示。

2 結果與分析

2.1 熱處理蒜氨酸產物的初步鑒定

圖1為加熱后留存于液相部分的受熱分解形成物的總離子流圖。由圖1可見,蒜氨酸的熱分解產物十分復雜、且較難以分離,只選擇峰型較好的物質進行鑒定。

圖1 蒜氨酸受熱分解形成產物的總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram of alliin’s decomposition products

2.1.1S-烯丙基-半胱氨酸

圖2 保留時間約為2.72 min的產物的正離子模式質譜圖(A)和負離子模式質譜圖(B)Fig.2 Mass spectrum of the product whose retention time is 2.72 min with positive ion mode (A) and negative ion mode (B)

如圖2所示，總離子流圖中保留時間約為2.72 min的產物的質譜圖中出現[M+H]+=162.4的正離子和[M-H]-=160.2的負離子，說明該產物的分子質量為161(奇數)。結合蒜氨酸的分子質量(MW=177)，可推測該產物比蒜氨酸少1個氧原子，這應當是蒜氨酸的亞砜鍵熱解斷裂而生成的SAC，其結構如圖3中的(2)所示。

2.1.2 烯丙基丙氨酸基活性硫

通過解析LC-MS得到的質譜圖，發現蒜氨酸熱處理產物中有一些化合物的分子質量呈規律變化。如表1所示，化合物1、2和3的分子質量與SAC的分子質量相差32的整數倍，且碎片離子也有一定的相似程度，因此這幾個產物的分子式中可能比SAC多了n(n=1，2或3)個硫原子或氧原子；但因低分辨質譜中2個氧原子的原子量為32.00約等于1個硫原子的原子量(32.06)，這2種情況無法區別而難以對其確認。另外，由于磺酸、次磺酸、亞磺酸、磺酸硫酯、二砜等含有較多氧原子的化合物極性均較大，不符合它們在總離子流圖中的出峰順序，從極性上看，只有硫烷類化合物符合離子流的出峰順序，因此推測這3種化合物為烯丙基丙氨酸基RSS化合物，其分子結構如圖3中的(3)、(4)和(5)所示。

基于上述推測，表1中m/z=105、120、137和152的離子峰恰好是由RSS中的C—S鍵和S—S鍵斷裂(同時可能有質子的遷移)所產生的碎片離子峰。例如，化合物(3)在ESI正離子模式下的裂解過程可表示為圖4。換言之，圖3中所推測的烯丙基丙氨酸基二硫烷結構可在質譜圖中得到較好的驗證。此外，KANG等[13]在加熱過的大蒜中曾發現過烯丙基丙氨酸基三硫烷，其質譜離子峰m/z=226、152和137與本實驗的結果是一致的。

表1 烯丙基丙氨酸基活性硫的質譜信息Table 1 MS of allyl alanine sulfides

圖3 蒜氨酸加熱過程中硫烷類化合物的可能形成途徑Fig.3 Formation of sulfide from thermally degraded alliin

圖4 化合物(3)的質譜裂解過程Fig.4 The pyrolysis of compound (3) in mass spectrometer

2.1.3 雙丙氨酸基活性硫

除上述烯丙基丙氨酸基RSS外，質譜圖中還有另外3個分子質量具有同樣質量差異規律的產物離子，如表2所示。由于這幾個化合物極性很大，其出峰順序十分靠前，導致其在色譜柱中的分離效果不是很好。但是，根據其分子質量、極性的大小以及氮數規律，可推測這3種化合物的結構式如圖3中的(6)、(7)和(8)所示。

表2 雙丙氨酸基活性硫的質譜信息Table 2 MS of dialanine sulfides

2.2 蒜氨酸熱處理產物-丙氨酸硫烷類物質的確證

2.2.1 S-烯丙基-半胱氨酸(SAC)

如圖5所示為總離子流圖(圖1)中保留時間為2.72 min的產物與SAC標準品的MS/MS圖，由圖可知它們的二級碎片離子基本相同，且其中m/z=73和145的碎片離子峰也與已有文獻中SAC的碎片離子峰一致[13],這證實了SAC確實是蒜氨酸的分解產物之一。

圖5 SAC標準品(A)與圖4中保留時間為2.72 min的產物(B)的二級質譜圖Fig.5 MS/MS spectrums of standard SAC sample (A) and the product of which retention time is 2.72 min (B)

2.2.2 烯丙基丙氨酸活性硫和雙丙氨酸基活性硫

UPLC-HRMS的結果表明，圖3中所推測的蒜氨酸分解產物的分子式均存在，如表3所示，這些物質在UPLC中的出峰順序也符合它們的極性順序。此外，HRMS的結果還表明：磺酸、次磺酸、亞磺酸、磺酸硫酯和二砜等這類含有較多氧原子的化合物均不存在。

KUBEC等[15]測得蒜氨酸加熱后生成的主要揮發性成分中含有二烯丙基一硫醚、二烯丙基二硫烷、二烯丙基三硫烷和二烯丙基四硫烷，其結構分別如圖3中的(9)、(10)、(11)和(12)所示。這些雙烯丙基RSS與本實驗所推測的產物在結構上均為烯丙基或丙氨酸基取代的RSS化合物，即它們在加熱過程中具有相似的裂解與重組途徑，這間接佐證了本文所推測的各種產物結構式的合理性。此外，由于烯丙基丙氨酸基RSS和雙丙氨酸基RSS中含有羧基，而羧基易形成氫鍵使得它們在水溶液中具有較高的溶解度和沸點，這可以解釋這些物質在加熱后仍留存于水相部分而不是同低沸點的雙烯丙基RSS(見圖3)一起成為揮發物這一事實。此外，結合表3中各個化合物的峰面積和KUBEC等的實驗，我們推測蒜氨酸熱處理產物中各類RSS化合物的含量均隨分子中S原子個數的增加而減少，這表明RSS化合物中硫原子的個數會隨著加熱時間的延長或熱處理強度的提高而增加(如圖3中的虛線箭頭所示)。根據這些分析，我們認為蒜氨酸分解形成RSS化合物的途徑，可以歸結為圖3-A所示。

表3 高分辨質譜的結果Table 3 Result of high resolution mass spectrum

3 討論

3.1 活性硫的形成機制

根據楊波[16]和朱根權[17]的研究，硫烷類化合物的熱處理與轉化很可能是通過自由基歷程進行的。因此，可以推測本實驗發現的烯丙基丙氨酸基RSS和雙丙氨酸基RSS的生成也是通過自由基歷程來實現的。例如，在蒜氨酸的熱解過程中，烯丙基丙氨酸基三硫烷的可能形成機理如圖6所示。

除了C—S鍵均裂產生的自由基重新組合這一途徑，根據YU等[18]的觀點，在上述途徑發生的同時，蒜氨酸中的亞砜鍵可能重排產生次磺酸中間體，進而生成烯丙基醇和半胱氨酸等中間產物，然后這些中間產物再與均裂途徑產生的自由基發生鏈反應生成RSS。

根據上述分析，我們推測有關RSS化合物的合成機制如圖3-B所示。

圖6 烯丙基丙氨酸基三硫烷的可能生成機理之一Fig.6 The proposed pathway of formation of allyl alanine trisulfide

3.2 蒜氨酸生成SAC的新途徑

SAC是一種具有抗氧化活性、抗癌活性、神經營養活性等多種生理活性的化合物[19-20]，一般認為其由γ-谷氨酰半胱氨酸在γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GTP)的作用下轉化生成[21-22]。而本實驗的結果證實了由蒜氨酸直接加熱生成SAC，這是一新獲得SAC的新途徑，這一途徑可以解釋大蒜在高溫加工過程中，γ-GTP失活但SAC含量上升的事實[23]。但從總離子流圖中各個峰的相對大小來看，SAC僅是蒜氨酸熱處理產物的一小部分。

3.3 推測烯丙基丙氨酸基RSS和丙氨酸RSS具有烯丙基RSS類似的生物活性

由于烯丙基丙氨酸基RSS和雙丙氨酸基RSS與雙烯丙基RSS均具有RSS結構，且雙烯丙基RSS具有抗菌、抗癌和阻止結腸細胞的增殖與轉移等生理作用[24]，因此可以推測本文發現的具有類似功能基團的RSS產物也具有相似的生理功能。已有相關報道表明烯丙基丙氨酸基三硫烷具有抗菌活性[25]，烯丙基丙氨酸基二硫烷可以阻止結腸癌細胞增殖[26-27]。目前市場上十分受歡迎的黑蒜以及大蒜汁飲料均有許多對人體有益的生理功效[28-29]，這些功效很可能與圖3中的RSS有關，但這有待進一步確證。

本實驗發現的蒜氨酸分解產物烯丙基丙氨酸基四硫烷尚無相應的CAS登錄號，即該化合物有可能是首次發現。其他RSS均被證實可直接由蒜氨酸熱分解產生，這闡明了加熱過的大蒜中烯丙基丙氨酸基三硫烷的來源[30]。

[1] 崔榮江, 張華, 徐文藝, 等. 我國大蒜機械化生產現狀及發展思路探討. 農機化研究, 2015(3): 264-268.

[2] BANERJEE R, MAULIK S K. Effect of garlic on cardiovascular disorders: A review[J]. Nutr,2002(19)： 1-4.

[3] SCHAFER G, KASCHULA C H. The immunomodulation and anti- inflammatory effects of garlic organosulfur compounds in cancer chemoprevention[J]. Anticancer Agents Med. Chem, 2014(14): 233-240.

[4] ICIEK M, KWIECIEN I, WODEK L. Biological properties of garlic and garlic-derived organosulfur compounds[J]. Environ. Mol. Mutagen, 2009(50): 247-265.

[5] 賈江濱, 許重遠, 羅景慧, 等. 大蒜中含硫氨基酸研究進展[J]. 中草藥, 2000, 31(6): 70-72.

[6] 金紅芳, 趙曼曼, 耿彬, 等. 內源性含硫氨基酸代謝與心血管損傷和修復[J]. 生理科學進展, 2012, 43(5): 330-333.

[7] 趙國華, 闞建全, 陳宗道. 含硫氨基酸食品功能性[J]. 糧食與油脂, 1999(4): 35-37.

[9] BENAVIDES G A, SQUADRITO G L, MILLS R W, et al. Hydrogen sulfide mediates the vasoactivity of garlic[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A， 2007(104)：17 977-17 982.

[10] 胡興鵬, 周華, 杜陽敏, 等. 蒜氨酸的熱分解及其機理分析[J]. 食品科學, 2017, 38(3): 64-68.

[11] 黃雪松, 陳子興. 蒜氨酸的熱解動力學研究[J]. 食品安全質量檢測學報, 2017(3): 930-934.

[12] 李文清, 周華, 胡興鵬等. 大蒜素和有機溶劑對蒜氨酸酶活性及大蒜油組成的影響[J]. 現代食品科技, 2014, 30(11): 80-83.

[13] KANG S S, LIM D R, KYUNG K H. 3-(allyltrisulfanyl)-2-aminopropanoic acid, a novel nonvolatile water-soluble antimicrobial sulfur compound in heated garlic[J]. Journal of Medicinal Food, 2010, 13(5): 1 247-1 253.

[14] ELKAYAM A, PELEG E, GROSSMAN E, et al. Effects of allicin on cardiovascular risk factors in spontaneously hypertensive rats[J]. Israel Medical Association Journal, 2013, 15(3): 170-173.

[15] KUBEC R, VELISEK J, DOLEZAL M, et al. Sulfur-containing volatiles arising by thermal degradation of alliin and deoxyalliin[J]. Journal of Agriculturaland Food Chemistry, 1997, 45(9): 3 580-3 585.

[16] 楊波, 王樹青, 田松柏, 等. 硫醚類硫化物的熱解及腐蝕性研究, 石油化工腐蝕與防護, 2010, 27(4): 17-20.

[17] 朱根權, 夏道宏, 闕國和. 含硫化合物熱解規律的研究燃料化學學報, 2000, 28(6): 518-521.

[18] YU T H, WU C M, ROSEN R T, et al. Volatile compounds generated from thermal degradation of alliin and deoxyalliin in an aqueous solution[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 1187(1): 370-402.

[19] LEE Y R, LEE Y K, HWANG I G, et al. Optimization of the processing conditions for heated garlic juice by response surface methodology[J]. Journal of Food Science & Nutrition, 2008, 13(4): 334-339.

[20] SHUKLA Y, KALRA N. Cancer chemoprevention with garlic and its constituents[J]. Cancer Letters, 2007, 247(2): 167-181.

[21] AMAGASE H, PETESCH B L, MATSUURA H, et al. Intake of garlic and its bioactive components[J]. Journal of Nutrition, 2001, 131(3s): 955S.

[22] XU X, MIAO Y, CHEN J Y, et al. Effective production of S-allyl-L-cysteine through a homogeneous reaction with activated endogenous gamma-glutamyltranspeptidase in garlic (Allium Sativum)[J]. Journal of Food Science and Technology, 2015, 52(3): 1 724-1 729.

[23] LEE S, YOO M, KIM S, et al. Identification and quantification of S-allyl-l-cysteine in heated garlic juice by HPLC with ultraviolet and mass spectrometry detection[J]. LWT-Food Science and Technology, 2014, 57(2): 516-521.

[24] LAI K C, HSU S C, KUO C L, et al. Diallyl sulfide, diallyl disulfide, and diallyl trisulfide inhibit migration and invasion in human colon cancer colo 205 cells through the inhibition of matrix metalloproteinase-2, -7, and -9 expressions[J]. Environmental Toxicology, 2013, 28(9): 479-488.

[25] KANG S S, LIM D R, KYUNG K H. 3-(allyltrisulfanyl)-2-aminopropanoic acid, a novel nonvolatile water-soluble antimicrobial sulfur compound in heated garlic[J]. Journal of Medicinal Food, 2010, 13(5): 1 247-1 253.

[26] SHIRIN H, PINTO J T, KAWABATA Y, et al. Antiproliferative effects ofS-allylmercaptocysteine on colon cancer cells when tested alone or in combination with sulindac sulfide[J]. Cancer Research, 2001, 61(2): 725-731.

[27] XIAO J, CHING Y P, LIONG E C, et al. Garlic-derived S-allylmercaptocysteine is a hepato-protective agent in non-alcoholic fatty liver disease in vivo animal model[J]. European Journal of Nutrition, 2013, 52(1): 179-191.

[28] CHOI I S, CHA H S, LEE Y S. Physicochemical and antioxidant properties of black garlic[J]. Molecules, 2014, 19(10): 16 811-16 823.

[29] LAWAL A O, LAWAL A F, OLOGUNDUDU A, et al. Antioxidant effects of heated garlic juice on cadmium-induced liver damage in rats as compared to ascorbic acid[J]. Journal of Toxicological Sciences, 2011, 36(5): 549-557.

[30] ELKAYAM A, PELEG E, GROSSMAN E, et al. Effects of allicin on cardiovascular risk factors in spontaneously hypertensive rats[J]. Israel Medical Association Journal, 2013, 15(3): 170-173.