小曲中優質產酯酵母分離鑒定及其產酯條件優化

王鵬昊，關統偉，張習超，趙順先，向慧平，張家旭，趙小林，歐夢瑩，林宜錦，許琴

1(西華大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610039) 2(成都蜀之源酒業有限公司，四川 大邑，611330)

小曲也被稱作酒藥、酒餅、米曲，是小曲酒生產過程中的糖化發酵劑，在小曲酒釀造過程中同時起著糖化和發酵的雙重作用。乙酸乙酯是小曲酒中的主體香味成分，同時也是我國清香型白酒的主體香氣組成成分[1]。在清香型白酒的所有酯類物質中，乙酸乙酯在酯類物質中處于主導地位，其含量高低很大程度決定著清香型白酒的質量及風格。并且在小曲原酒中，乙酸乙酯含量高的酒香味好，提高乙酸乙酯含量有利于提高原酒質量。而在小曲酒釀造過程中所產生的乙酸乙酯主要是由小曲中微生物代謝產物的生化反應生成的，酵母在其中扮演了重要角色。酵母在白酒釀造發酵過程中能夠產生多種物質，主要有酯類、醇類、酸類等，此外還會有少量的烷烴類、胺類、芳香烴類、酮類、醛類等物質產生。這些物質的含量各異，從而構成了各酵母菌的不同發酵香氣。產香酵母在酒的發酵釀制過程中的主要作用是產酯(在小曲酒或清香型白酒中主要是乙酸乙酯)，對酒體具有增酯、提香的作用，故又稱其為生香酵母[2]。產香酵母可以利用有機酸、糖、醛以及鹽類物質為原料，在酯酶的參與下合成眾多酯類物質，以此來增香，去除酒中的雜味，從而使酒體協調，改善小曲酒的品質[3-5]。目前，產酯酵母廣泛應用于小曲酒生產中。我國作為白酒生產大國，具有優質的天然曲種資源，但國內土著生香酵母曲工業化開發的并不是很多，本實驗旨在從釀酒小曲中分離得到優良產酯酵母，并對其產酯條件進行優化研究，為我國土著產酯酵母在白酒工業化生產的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

釀酒小曲由成都蜀之源酒業有限公司、瀘州自然香實業有限公司和四川省瀘州市美酒源酒業有限公司提供。

1.1.2 主要實驗試劑

葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、酵母浸膏、H2SO4、HCl、NaCl等常規試劑均購自成都市科龍化工試劑廠；真菌DNA提取試劑盒、蛋白酶K、溶菌酶、膠回收試劑盒等購自上海生工成都分公司。

1.1.3 篩選培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

查氏培養基：蔗糖30 g，NaNO33g，7H2O·MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·4H2O 0.01 g，K2HPO41 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0～6.5。

孟加拉紅培養基:蛋白胨5 g，葡萄糖10 g， KH2PO41 g，瓊脂20 g， MgSO4·7H2O 0.5 g， 1 g/L孟加拉紅溶液3.3 mL，蒸餾水1 000 mL。

1.1.4 活化培養基

液體YEPD培養基：葡萄糖2 g， 酵母提取物1 g， 蛋白胨2 g，蒸餾水100 mL。

1.1.5 產酯培養基

葡萄糖8 g，酵母提取物1 g，蛋白胨2 g，蒸餾水100 mL。

1.2 主要儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋DHP-902，上海中安醫療器械廠；電熱恒溫培養箱LDX-75KB，北京市六一儀器廠；真空干燥箱 SWJ-2F，上海一恒科技有限公司；恒溫水浴鍋 TB-214，金壇市醫療儀器廠；旋轉蒸發儀RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠；雙定時電泳儀MLS-1，上海益恒實驗儀器有限公司，旋渦震蕩儀DY-8C，蘇州凈化設備有限公司；數顯式酸度計AR-323，上海精宏實驗設備有限公司；電子天平HH-S，北京賽多利斯儀器系統有限公司;HSS 86.50 型全自動頂空進樣器，意大利 DANI公司;氣相色譜質譜聯用儀GCMS-QP2010 plus，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的初篩

取1 g樣品小曲粉加入到裝有10 mL無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩搖勻，此時的稀釋倍數為10-1倍；然后用移液槍從試管中移取1 mL菌懸液并加入9 mL無菌生理鹽水，振蕩搖勻，此時稀釋倍數為10-2倍；逐級稀釋可制得10-3、10-4、10-5倍的樣品稀釋液。取100 μL 10-4和10-5倍的稀釋菌液均勻涂布于PDA、查氏培養基、孟加拉紅培養基上，28 ℃培養48 h后，挑菌在PDA培養基純化。

1.3.2 產酯菌株篩選

用接種環將純化后得到的菌株接種一環到液體活化培養基中，經28 ℃活化培養24 h，隨后取液體培養基10 mL接種到100 mL產酯培養基中，28 ℃恒溫培養4 d。然后向發酵液再加入20 mL無水乙醇以及40 mL蒸餾水后進行蒸餾(可加入幾滴植物油做消泡劑)，收集100 mL蒸餾液，再對蒸餾液進行總酯與乙酸乙酯的測定。

1.3.3 總酯的測定

總酯測定方法為皂化回流法[6-8]。

1.3.4 蒸餾液的GC-MS分析條件。

蒸餾液中的乙酸乙酯含量分析采用GCMS-QP2010 plus進行分析。分析條件為：色譜柱為Rtx-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 um)；程序升溫為35 ℃保持2 min，以10 ℃/min至 250 ℃，保持5 min。進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，無分流進樣。載氣，高純He(99.99%)；載氣流速 1.0 mL/min。電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，全掃描模式，質量掃描范圍為40～600。

1.3.5 高產酯菌株的分子鑒定與形態及生理生化觀察

優質產酯菌株經溶菌酶破壁后使用真菌DNA提取試劑盒提取DNA。以ITS4和ITS5為引物進行PCR擴增，50 μL PCR反應體系為：10×PCR buffer 5 μL； dNTP4 μL；引物ITS4 1 μL；引物ITS5 1 μL；DNA模板1 μL；TaqDNA聚合酶0.5 μL；ddH2O 37.5 μL。PCR條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30次循環；修復延伸72 ℃ 5min。PCR產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化產物送往上海生工成都分公司測序，將測序序列在NCBI數據庫中進行同源性檢索，使用MEGA6.0構建系統發育樹[9-10]。

初步生理生化實驗鑒定參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[11]對產酯菌株進行測試，主要包括糖發酵實驗、碳源同化實驗、類淀粉物質生成實驗、尿素水解實驗等。

1.3.6 產酯條件的研究

1.3.6.1 單因素試驗對產酯量的影響

將優質產酯菌株按不同條件分別接種于產酯培養基中，靜置培養，以產酯量和乙酸乙酯生成量為考察指標，研究溫度、pH、酒精添加量以及發酵時間對菌株生長情況的影響[12]，以確定各單因素最佳條件范圍。用0.1 mol/L鹽酸來調節pH值，用無水乙醇調節酒精含量，實驗方法參照1.3.2，對餾液進行總酯和乙酸乙酯的測定。

1.3.6.2 正交實驗

以4因素4水平做正交實驗[13-14]，以此探究溫度、pH、酒精添加量以及發酵時間對菌株產酯量的影響，產酯條件水平表如表1所示。

1.3.7 數據處理

數據分析采用spss19.0軟件Duncan方差齊性檢驗進行顯著性差異分析[15-16]。

2 結果與分析

2.1 優質產酯酵母的篩選

從樣品小曲中經分離培養基初步分離純化得到了7株疑似酵母菌的菌株，再將篩選得到的這7株菌株采用產酯培養基復篩，其產酯情況結果見表2。表2表明，在初篩的7株酵母菌中，產酯情況差異較大，總酯含量最高的為菌株Y5，總酯達2.684 g/L，乙酸乙酯含量為2.481 g/L，占總酯量的92.4%，顯著高于其他菌株。總酯含量最低的為Y3菌株，總酯0.014 g/L，其乙酸乙酯含量并未檢出。為此本實驗選用Y5菌株作為產酯優質菌株以繼續進行后續實驗的研究。

表2 篩選菌株產酯情況Table 2 Screening strains of producing strains

注：“-”表示乙酸乙酯含量極低或未檢出其含量。

2.2 Y5菌株的鑒定

2.2.1 Y5菌株的形態學觀察及生理生化試驗

觀察Y5的菌落形態：如圖1所示，Y5菌株的菌落呈白色，菌落直徑1～2 mm，圓形凸起、表面光滑，邊緣整齊，大小均勻，有水果香；液態培養時表面有菌膜，液體澄清。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》，進一步得出其生理生化試驗結果：如表3所示，Y5菌株可利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、D-甘露醇和檸檬酸，不能利用乳糖、D-木糖和L-鼠李糖，可利用硝酸鹽作為氮源，不能產生類淀粉物質，可分解利用尿素。

圖1 Y5菌株劃線平板圖Fig.1 Y5 strain crossed plate chart

生理生化試驗項目結果葡萄糖+乳糖-蔗糖+D?木糖-L?鼠李糖-海藻糖+麥芽糖+D?甘露醇+檸檬酸+硝酸鹽利用+類淀粉物質生成-尿素水解試驗+

注：“+”代表能夠利用；“-”代表不能利用。

2.2.2 菌株Y5的分子鑒定

在生理生化試驗基礎上，進一步對Y5酵母的DNA產物進行了PCR擴增，PCR擴增結果如圖2所示，所擴增得到的片段的電泳條帶亮度大，無拖尾，通過與D2000 Maker的對比，可以知道擴增得到的分子大小在600 bp左右，與預測擴增片段的長度一致。

圖2 PCR產物的瓊脂凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products

將PCR擴增產物送往上海生工成都分公司進行測序，再將其序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行Blast比對，比對結果表明Y5菌株與公布的WickerhamomycesanomalusCBS250(登錄號： KY105862)同源性達到99.7%，利用MEGA6.0軟件構建系統發育樹，如圖3所示。結合Y5生理生化實驗結果與Y5系統發育樹，可確定Y5為異常威克漢姆酵母。

圖3 菌株Y5系統發育樹Fig.3 Strain Y5 phylogenetic tree

2.3 Y5產酯條件單因素試驗

2.3.1 溫度對產酯量的影響

發酵溫度對總酯產量與乙酸乙酯產量的影響見圖4，總酯含量與乙酸乙酯含量隨著溫度的升高，呈現先升后降的趨勢。溫度的高低直接影響酵母菌體內的酯化酶活性，進而影響酵母菌產酯能力，且溫度的升高會加速酯的水解及揮發。綜和總酯含量和乙酸乙酯的生成量，發酵溫度為30 ℃時二者含量達到最高(總酯產量為3.197 g/L，乙酸乙酯含量為2.941 g/L)，酯化酶的活性達到最大，因此選擇發酵溫度為30 ℃。

圖4 溫度對產酯量的影響Fig.4 Effect of temperature on the amount of ester produced

2.3.2 pH對產酯量的影響

如圖5所示，培養基的pH對酵母菌酯的生成量影響較大，隨著pH的增加，總酯產量和乙酸乙酯生成量顯著提高，但是pH過大會使得二者含量下降。綜合看來培養基的pH值在pH 4～6的范圍內總酯和乙酸乙酯的生成量較高，當pH值偏高或偏低時，其生成乙酸乙酯的能力會有所下降，從而導致總酯的含量較低。其中，當培養基的初始pH值為pH 5時，總酯和乙酸乙酯的生成量達到峰值，總酯含量達到3.629 g/L，乙酸乙酯生成量為3.198 g/L。

圖5 pH對產酯量的影響Fig.5 Effect of pH on the amount of ester produced

2.3.3 酒精含量對產酯量的影響

從圖6可知，酵母菌Y5對乙醇有較好的適應性，在培養基中加入一定的乙醇對菌株產酯有一定的促進作用，但是過量的乙醇對酵母的產酯性能有一定的抑制作用。隨著乙醇添加量的增加，總酯產量和乙酸乙酯產量都呈現先升后降的趨勢，乙醇添加量為2%時產酯量達到最高，當乙醇添加量超過2%時，酯含量反而下降，不利于乙酸乙酯的生成。因此選擇乙醇添加量為2%，此條件下總酯含量達到3.579 g/L，乙酸乙酯生成量為3.185 g/L。

圖6 酒精含量對產酯量的影響Fig.6 Effect of alcohol content on the amount of ester produced

2.3.4 發酵時間對產酯量的影響

由發酵時間對產酯量的影響(圖7)可知，菌株Y5在不同發酵時間內產酯量有差異，并且發酵時間對菌株產酯量的影響較大，隨著發酵時間的增長，酵母的生長急劇上升，此時酵母的產酯代謝較為旺盛，其總酯含量和乙酸乙酯產量在第4天時達到峰值，產量分別為3.687 g/L和3.204 g/L。而后隨著發酵時間的延長，產酯量呈現下降的趨勢，在第5～6天下降趨勢明顯，可能原因是隨著時間延長酵母代謝產生的酯類物質揮發。

圖7 發酵時間對產酯量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on the amount of ester produced

2.4 正交實驗結果與分析

在單因素實驗的基礎上，選取適當的因素范圍設計正交表，考察Y5菌株的最適產酯條件，產酯條件結果與極差分析見表4，方差分析見表5。

表4 產酯條件正交實驗結果Table 4 Production of orthogonal experiment results

表5 正交實驗方差分析表Table 5 Analysis of orthogonal experimental variance

注：方差分析表的置信區間為95.0%，“*”代表顯著。

如表4所示，根據極差分析，在A(溫度)、B(pH值)、C(酒精含量)、D(發酵時間)4個影響因素中pH值對產酯量影響最大，其影響的順序為pH值>發酵時間>酒精含量>溫度。使用SPSS19.0軟件對實驗結果進行方差分析，如表5所示，pH值與發酵時間這兩個因素對菌株產酯量的影響顯著(Sig<0.05)。并且通過試驗得出的最優組合為A3B2C3D2，即在溫度30 ℃、pH 4、乙醇體積分數4%、發酵時間3d時菌株產酯量達到最大，通過后續實驗測得Y5菌株在該條件下總酯產量為4.065 g/L，乙酸乙酯產量3.677 g/L；相比優化之前，其總酯含量顯著提高51.5%，乙酸乙酯含量顯著提高48.2%。

3 結論

從工業化釀酒小曲中分離篩選得到1株優質產酯酵母菌株Y5，經產酯培養基初篩其總酯達2.684 g/L，乙酸乙酯含量為2.481 g/L，經生理生化實驗和分子鑒定，確定Y5菌株為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。目前應用于白酒中的產酯酵母多屬于漢遜酵母、產朊酵母屬、假絲酵母屬和球擬酵母屬等[17]，本實驗的分離鑒定豐富了白酒中產酯酵母的菌種資源，為該種酵母在白酒生產利用提供了理論基礎。

通過正交實驗將菌株Y5的產酯條件進行優化。根據極差分析，在A(溫度)、B(pH值)、C(酒精含量)、D(發酵時間)4個影響因素的順序為pH值>發酵時間>酒精含量>溫度，方差分析結果表明pH值與發酵時間對菌株產酯量的影響顯著，試驗得出的最優產酯條件為：在初始pH 4、乙醇體積分數4%的培養基中30 ℃恒溫發酵3 d。在該條件下Y5菌株總酯產量為4.065 g/L，乙酸乙酯產量3.677 g/L；相比優化之前，其總酯含量顯著提高51.5%，乙酸乙酯含量顯著提高48.2%。根據嚴錦等[1]報道，從清香型小曲中分離出一株異常漢遜式酵母，其產乙酸乙酯和總酯能力分別為2.152 g/L和2.368 g/L；陳維新等[12]以腐爛菠蘿為原料，篩選出一株馬克斯克魯維酵母，其乙酸乙酯的最高產量達3.13 g/L。綜合看來，本實驗篩選出的Y5菌株具有較強的產酯能力，可作為白酒釀造生產中重要的產酯菌種資源，為國內土著生香酵母曲工業化開發提供理論依據，具有較好的應用前景。關于該菌株在小曲酒或相關白酒中的具體應用還需作進一步研究。

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