pH和NaCl質量濃度對發酵魚糜中腐敗菌Aeromonas veronii bv.veronii群體感應的影響

趙丹丹，劉琳，王迪，呂飛，丁玉庭，陳文烜，周緒霞*

1(浙江省農業科學院 食品科學研究所，浙江 杭州，310021)2(浙江工業大學 海洋學院，浙江 杭州，310014)

微生物引起的食品腐敗變質是在基因水平受到群體感應(Quorum sensing，QS)調控的一種依賴菌體濃度發生的現象[1-3]。細菌通過QS系統來調控自身一些生理機能的表達，如生物膜的形成、鞭毛運動等毒力因子的表達，從而提高細菌的致病性以及在食品中的致腐性[4]。目前革蘭氏陰性菌的QS系統主要是由N-酰基高絲氨酸內酯(N-acyl homoserine lactone，AHL)類信號分子調控。

氣單胞菌是食品中常見的腐敗菌[5-6]，可通過產生胞外酶、生物膜、腸毒素和溶血素等引起食品腐敗變質，降低食品安全性[7-8]。本實驗室在前期研究過程中開發了一種可以將魚糜高值化利用的真菌發酵技術[9]，并在發酵魚糜中篩選到了1株具有較強致腐能力的腐敗菌，Aeromonasveroniibv.veronii。在研究過程中發現，A.veroniibv.veronii具有AHLs介導的QS系統，且其QS系統表達在培養過程中受環境變化發生改變。由此推測食物基質中存在的化合物和儲藏環境會影響細菌的QS系統的表達[10]，且會進一步影響細菌的致腐性與致病性，因此研究環境因素對腐敗菌的QS及相關代謝行為的影響對水產品的品質控制具有重要意義。目前僅有外國學者研究了培養條件對Aeromonashydrophila的QS系統的影響[10-11]，關于A.veroniibv.veronii的QS相關研究還未有報道。

本項目主要以發酵魚糜中的腐敗菌A.veroniibv.veronii為研究對象，研究環境因素(pH、NaCl質量濃度)對細菌A.veroniibv.veronii產AHLs活性、生物膜的形成及泳動能力的影響。該研究將加深對氣單胞菌的QS現象的理解，為通過調控QS降低細菌毒性進而防止食品腐敗的新策略提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

菌種：A.veroniibv.veronii，分離于發酵魚糜；根癌農桿菌AgrobacteriumtumefaeiensA136(pCF218/PCF372)，壯觀霉素抗性，用量為50 μg/mL。所有菌種添加20%甘油保存于本實驗室-80 ℃冰箱中。

試劑：鹽酸、氯化鈉、碳酸鈉、甲酸、乙酸乙酯、三氯甲烷等為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇等為色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；營養肉湯(NB)、NB固體培養基、瓊脂粉等，青島海博生物技術有限公司；壯觀霉素、X-gal、鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(oNPG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇、Z-buffer、結晶紫，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C型數顯酸度計，上海精科儀器有限公司；YXQ-LS-SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，SW-CT-4D潔凈工作臺，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DHP-9162型電熱恒溫培養箱，上海恒科學儀器有限公司；CR21GⅡ高速離心機，日本Hitachi公司；FV300激光共聚焦顯微鏡，日本OLYMPUS；SPECTRAmax M5酶標儀，美國Molecular Devices公司； StepOne型熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 pH值對細菌菌落總數和AHLs活性的影響

首先配制不同pH值(6.0、7.0、8.0)的NB液體培養基(含5 g/L NaCl)。將待測菌過夜活化12 h，利用生理鹽水制備菌懸液，接種于不同pH值的100 mL NB培養基中，終濃度為1×103CFU/mL。30 ℃搖床培養18 h至細菌達生長穩定期，測定培養液中細菌的菌落總數及產生的AHLs活性。培養基的pH值用1 mol/L HCl溶液進行調節。

1.3.2 NaCl質量濃度對細菌菌落總數和AHLs活性的影響

首先配制不同NaCl質量濃度的(5、10、20 g/L)的NB液體培養基，且各培養基pH固定為7.0。將待測菌活化12 h，利用生理鹽水制備菌懸液，接種于不同含鹽量的100 mL NB培養基中，終濃度為1×103CFU/mL。30 ℃搖床培養18 h至細菌達生長穩定期，測定培養液中細菌的菌落總數及產生的AHLs活性。

1.3.3 菌落總數的測定

按照GB/T 4789.2—2008的方法計數。

1.3.4 AHLs的活性測定

A.veroniibv.veroni在不同條件下的AHLs活性通過監測報告菌根癌農桿菌的β-半乳糖苷酶活性來反映。待測菌的β-半乳糖酶活性參照PONNUSAMY等[12]的方法來測定。將報告菌A.tumefaciensA 136 活化12 h后，用NB液體培養基按一定比例稀釋至1×103CFU/mL，加入200 μL待測菌的培養上清液，培養至OD600≈0.6左右，記錄OD600。另取5 mL離心管，依次加入800 μL Z-buffer、200 μL培養12 h的菌液、100 μL 0.1%SDS、150 μL三氯甲烷，充分振蕩，加入100 μL的4 mg/mLoNPG，充分振蕩，置于28 ℃的水浴中，待溶液變黃之后，加入600 μL的1 mol/L Na2CO3溶液終止反應，記錄反應時間。將反應液離心(10 000 r/min，5min)，測OD420。根據變色時間，OD420和OD600計算β-半乳糖苷酶的活性。每個處理設3個重復，以NB培養基做陰性對照。酶活力單位定義為：在所在條件下，每分鐘分解1 moloNPG所需要的量為1個酶活力單位。計算公式為：酶活力=(1000×OD420)/(OD600×T×0.2 mL)，其中T為添加菌液的體積反應時間，單位為min。

(1)

1.3.5 生物膜形成能力的測定

參照PACKIAVATHY等[14]的方法，利用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)技術觀察待測菌的生物膜在不同培養條件下的結構變化。取1 mL不同pH值(6.0、8.0)和不同含鹽量(5、20 g/L)的NB培養基,加入24孔板中，同時將待測菌的生理鹽水菌懸液，按1∶1 000的比例稀釋，加入直徑為1 cm的圓形蓋玻片30 ℃靜置培養24 h。將蓋玻片取出，用無菌水輕輕沖洗玻片上未粘附的細胞，用0.1%吖啶橙染色1 min。洗去多余的染色液，將蓋玻片置于CLSM下觀察，該顯微鏡裝有激發波長為515～560 nm的激發濾光器及60×(60倍)的油鏡，其熒光顯微鏡照片與光鏡照片均由Fluoview v5.0軟件獲得。

1.3.6 泳動能力的測定

參照PACKIAVATHY等[14]的方法，并稍作改動。首先制備不同pH值(6.0、7.0、8.0)和不同含鹽量(5、10、20 g/L)的NB固體培養基(含0.3%瓊脂)，滅菌后冷卻至50 ℃時倒平板，待凝。將待測菌活化12 h后，取1.5 μL細菌培養液分別點樣在含不同NB平板上，以無菌生理鹽水為對照，將平板置于30 ℃培養箱中培養24 h，觀察菌體變化拍照并測量菌落直徑。

1.3.7 數據統計分析

運用SPSS 21.0 軟件和Origin 8.5 軟件進行數據分析。測定結果以均值±標準差(n≥3)表示，采用最小顯著差異法(LSD)進行顯著性差異分析，顯著性水平為5%。

2 結果與分析

2.1 pH對A. veronii bv. veronii QS系統的影響

2.1.1 對菌落總數和產AHLs活性的影響

pH對A.veroniibv.veronii的菌落總數、產AHLs活性的影響見圖1。結果所示，在培養基初始pH值分別為6.0、7.0、8.0時，A.veroniibv.veronii的最大生長總數無顯著性差異(p>0.05)，分別為1.29、1.45、1.15×109CFU/mL。由此說明，pH范圍為6.0～8.0的培養條件對細菌的生長無顯著影響，即細菌生長過程中培養液pH值的變化不影響細菌的生長狀態。

圖1 不同pH對A. veronii bv. veronii菌落總數和AHLs活性的影響Fig.1 The effects of different pH on the bacterial counts and AHLs activity of A. veronii bv. veronii注：a-b不同字母表示同一指標內差異達到0.05的顯著水平。

通過監測報告，菌根癌農桿菌的β-半乳糖苷酶活性可用來反映A.veroniibv.veroni在不同pH條件下的AHLs活性。如圖1所示，當培養環境的初始pH為8.0時，A.veroniibv.veroni培養18 h后的AHLs活性顯著低于pH 6.0和7.0下的AHLs活性(p<0.05)。由此推斷，堿性環境會降低細菌分泌的AHLs活性。據報道，AHLs的高絲氨酸內酯環在堿性條件下易解環，具有結構不穩定性[15]。綦國紅[16]研究了不同pH對AHLs穩定性的影響，發現pH值越高，AHLs的活性越低。

2.1.2 對A.veroniibv.veronii成膜和泳動能力的影響

生物膜是細菌附著在物體表面的細胞及其胞外基質，是細菌產生耐藥性的主要原因[17]。在食品工業中，控制細菌生物膜的產生是亟待解決的重要問題。在本實驗中，利用結晶紫染色法和CLSM技術測定pH值對細菌成膜的影響，結果見圖2和圖3。

圖2 不同pH對A. veronii bv. veronii生物膜形成能力和泳動能力的影響Fig.2 The effects of different pH on biofilm formation and swimming motility of A. veronii bv. veronii注：a-b不同字母表示同一指標內差異達到0.05的顯著水平。

A-pH 6.0；B-pH 7.0；C-pH 8.0；a-熒光照片;b-光鏡照片圖3 在不同pH下A. veronii bv. veronii生物膜結構的CLSM照片Fig.3 The CLSM images of biofilm structure of A. veronii bv. veronii under different pH

結果顯示，在不同pH下，A.veroniibv.veronii的成膜能力受到一定影響。當環境的pH為8.0時，細菌的成膜能力均顯著低于pH 6.0、pH 7.0下的兩組數據(p<0.05)。由CLSM照片中可以觀察到，在pH 8.0時，細胞膜中的熒光強度和細胞密度明顯小于pH 6.0和pH 7.0的組別，且細胞膜的結構較為疏松，而pH為6.0和7.0的組別之間差異性較小。這說明，當環境呈堿性時，A.veroniibv.veronii的成膜能力顯著低于中性和酸性環境下細菌的成膜能力。這可能是因為在堿性環境下，細菌的QS系統受到影響，產生的AHLs活性降低，從而影響了其介導的生物膜形成能力。這與2.1.1中AHLs的活性變化是一致的。馬艷等[18]研究發現,環境pH為7時，菌株的生物被膜形成量最大，被膜中活菌數最多，且生長環境的pH值過低或過高均能夠抑制微生物生物被膜的形成。有研究表明，在酸性條件下細菌的胞外分泌物會發生變性，而堿性條件會影響菌體聚集，均不利于生物被膜的形成[19-20]。

同時，pH對A.veroniibv.veronii的泳動能力也有一定影響。泳動是細菌靠鞭毛進行的一種運動模式，指菌體在找到合適的固著位點后在固體平面上擴散，在生物膜形成的早期起著關鍵作用[21-22]。利用瓊脂平板法，將細菌點樣在不同酸堿性的平板上靜置培養，形成的菌團如圖4，直徑見圖2。結果顯示，當環境為pH 8.0時，細菌的泳動能力均顯著低于pH 6.0、pH 7.0兩組數據(p<0.05)，而pH 6.0和pH 7.0的組別之間無顯著性差異(p>0.05)。這與成膜能力的變化結果是一致的，是因為細菌的QS系統在堿性環境下受到影響，從而影響了其介導的泳動能力。目前關于pH對細菌泳動能力的影響還未有相關報道。

圖4 平板觀察法研究不同pH對A. veronii bv. veronii泳動能力的影響Fig.4 The effects of different pH on swimming motility of A. veronii bv. veronii using agar plates method

2.2 NaCl質量質量濃度對A. veronii bv. veronii QS系統的影響

2.2.1 對菌落總數和產AHLs活性的影響

NaCl質量濃度對A.veroniibv.veronii生長及AHLs活性的影響見圖5。由結果可知，在不同NaCl質量濃度(5、10、20 g/L)下，細菌A.veroniibv.veronii培養18 h達到穩定期后的生長最大數分別為1.66×109、7.24×108、1.55×107CFU/mL，且各組數據之間具有顯著性差異(p<0.05)。當NaCl質量濃度為5 g/L時，細菌的菌落數最高，隨NaCl濃度增加，菌落數減少。由此推斷，含鹽量為5 g/L的條件更適宜A.veroniibv.veronii的生長。

對不同鹽含量下A.veroniibv.veronii的AHLs活性變化分析發現，當NaCl質量濃度為20 g/L時，細菌的AHL活性顯著低于NaCl為5 g/L和10 g/L下的AHLs活性(p<0.05)，而在NaCl質量濃度為5 g/L和10 g/L下細菌的AHLs活性無顯著性差異(p>0.05)。JAHID等[11]分析了Aeromonashydrophila在不同含鹽量下培養24 h后產AHLs和AI-2信號分子的分泌情況，發現A.hydrophila在25 g/L含鹽量下信號分子的濃度或活性最高。MEDINA-MARTNEZ等[10]利用ChromobacteriumviolaceumCV026和A.tumefaeiensA136兩種報告菌檢測了不同含鹽量(5～45 g/L)對不同A.hydrophila菌株產AHL的活性影響，發現A.hydrophila在高鹽含量下產AHLs活性為陰性，且當培養基含鹽量分別高于20、35 g/L時2株報告菌不能檢測到細菌的AHLs活性。在本試驗中，20 g/L的含鹽量減弱了細菌分泌AHLs的能力，因而認為，高含鹽量不利于A.veroniibv.veronii分泌AHLs信號分子。

2.2.2 對A.veroniibv.veronii成膜和泳動能力的影響

利用結晶紫染色法和CLSM技術研究不同NaCl質量濃度對細菌成膜能力的影響，結果分別見圖6和圖7。結果顯示，在5 g/L含鹽量的條件下，細菌的成膜能力最強，當培養基中含鹽量增加時，細菌成膜能力減弱。

圖6 NaCl質量濃度對A. veronii bv. veronii成膜和泳動能力的影響Fig.6 The effects of different NaCl concentration on biofilm formation and swimming motility of A. veronii bv. veronii注：a-c不同字母表示同一指標內差異達到0.05的顯著水平。

A-5.0 g/L NaCl;B-10 g/L NaCl；C-20 g/L NaCl;a-熒光照片;b-光鏡照片。圖7 在不同含鹽量下A. veronii bv. veronii生物膜結構的CLSM照片Fig.7 The CLSM images of biofilm structure of A. veronii bv. veronii under different NaCl concentration

利用CLSM觀察發現，當含鹽量為20 g/L時，細菌生物膜的細胞密度較小，且結構較為疏松。這說明培養基質中NaCl質量濃度的變化影響了細菌的QS系統表達，使細菌的成膜能力發生改變。而在馬艷等[18]的研究中，當NaCl質量濃度達到20 g/L時，菌株的生物膜形成量最大，活菌數最大。JAHID等[11]研究發現，細菌培養24 h后，其成膜能力在含2.5 g/L NaCl的基質中最強，當含鹽量為0或逐漸增加時，細菌的成膜能力顯著降低。然而，MCDOUGALD等[23]發現培養基質中營養物質和葡萄糖的含量是影響創傷弧菌生物膜形成的主要因素，而NaCl質量濃度與溫度并未影響其生物膜的形成。本實驗結果與這些文獻報道的差異性可能與細菌的來源和種類不同有關。

利用瓊脂平板法研究NaCl質量濃度(5、10、20 g/L)對細菌泳動能力的影響，如圖6和圖8所示，在20 g/L NaCl的條件下細菌形成菌團直徑顯著小于5 g/L和10 g/L NaCl下的菌團直徑(p<0.05)。細菌的泳動能力是受QS調控的行為，因而該變化與細菌QS在高NaCl下受到影響有關。在本實驗中，5 g/L和10 g/L NaCl下的菌團直徑大小無顯著性差異(p>0.05)。關于環境因素對細菌泳動能力的影響還少有報道。在JAHID等[11]的報道中，細菌的泳動能力在2.5 g/L NaCl條件下最強。

圖8 瓊脂平板法研究不同NaCl濃度對細菌泳動能力的影響Fig.8 The effects of different NaCl concentration on swimming motility of A. veronii bv. veronii using agar plates method

3 討論

研究發現，培養基初始pH為pH 8.0時能顯著降低細菌合成AHLs的能力、成膜能力及泳動能力(p<0.05),這說明堿性環境能阻礙細菌產生AHLs，進而阻礙QS系統對細菌行為的調控。另外，當培養基中的含鹽量為0.5%時細菌的生長菌落數最高；而2.0%的含鹽量抑制細菌的生長，并通過干擾細菌的QS系統，抑制了其成膜能力及泳動能力(p<0.05)。由此可見，pH和NaCl質量濃度能影響細菌QS系統及代謝行為的表達，這為通過調控細菌QS來控制水產品微生物安全的新策略提供理論基礎。

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