基于高通量測序瀏陽豆豉不同發酵階段微生物多樣性分析

石聰，李世瑞，李跑，廖盧艷，蔣立文*

1(湖南農業大學 食品科技學院，湖南 長沙，410128) 2(食品科學與生物技術湖南省重點實驗室 ，湖南 長沙，410128)

瀏陽豆豉是我國特色發酵大豆制品之一，低鹽或無鹽，是淡豆豉(SemenSojaepraeparatum)的典型代表之一，為藥食兩用發酵大豆制品。以黑豆作為原料，蒸熟后自然發酵7～15 d，加入一定比例的水適當洗曲后堆積發酵，至產生特殊的香氣，曬干脫水后而成。目前包括瀏陽豆豉在內的淡豆豉研究報告涉及到微生物的選育[1-4]、發酵工藝的選擇[5-8]、發酵過程品質與淡豆豉炮制與藥效的關系[9-11]等，其中對功能因子大豆異黃酮變化的研究最多。

目前關于傳統發酵產品微生物群體演變規律及不同階段微生物作用研究是人們關注的熱點[12-16]。本研究對傳統發酵的瀏陽豆豉中幾個主要階段微生物變化，采用454高通量測序方法，研究其微生物變化，探討可能與品質相關的優勢微生物，為這種藥材或食材的質量穩定提供可靠的微生物信息，實現多菌種混合發酵的穩態化發酵工藝，再將品質與藥材種炮制指標和食用時的色香味聯系起來，為發揚該產業奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

來源于湖南瀏陽某豆豉廠，為春秋季節制作。具體工藝見文獻[17]。用于樣品測試的成熟曲，洗曲濾干后發酵3 d和15 d，分別編號為LY01、LY02、LY03，樣品在無菌條件下包裝，于-80 ℃冷凍保藏備用。

1.2 樣品處理方法

1.2.1 微生物總DNA的提取與純化

(1)使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提DNA。

(2)基因組DNA的鑒定：抽提的基因組DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA無明顯降解、濃度合適、無雜質，方可進入下一步試驗。

(3)PCR擴增：按指定測序區域(細菌選用 V1-V3 區通用引物)，合成帶有“5’ 454 A、B接頭-特異引物3’”的融合引物。

PCR擴增引物，正向引物為：27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG-3′；反向引物為：533R: 5 ′-TTACCGCGGCTGCTG-GCAC-3′。真菌選定ITS區，合成帶有“5′454 A、B接頭-特異引物3′”的融合引物，A為測序端，需加標簽，B端引物可共用。以樣品總DNA為模板，真菌基因組DNA采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG G-3′)ITS4(5′-TCG-3′)ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物進行PCR擴增，PCR采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase。20μL 反應體系：5×Fastpfu Buffer 4 μL；2.5 Mm dNTPs 2 μL；正向引物(5 μmol/L) 0.4 μL/0.8 μL；反向引物(5 μmol/L) 0.4 μL/0.8 μL；FasterPfu Polymerase 0.4 μL； DNA模板 10 ng；補去離子水至20 μL PCR儀：ABI GeneAmp?9700型；細菌和真菌PCR擴增程序為：95 ℃預變性2 min(95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s);25個循環，72 ℃延伸5 min。每個樣品3個重復，將統一樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物，Tris_HCL洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

(4)熒光定量：參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluor-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例的混合。

(5)EmPCR：按照 Roche GS FLX Titanium emPCR Kits 的操作進行。

(6)測序：上海美吉生物公司進行測序。

1.2.2 生物信息分析[18-20]

OTU聚類：使用Qiime(vsesion 1.17 http://qiime.org/)軟件平臺對測序結果進行修剪、篩選、匹配和分析等。

物種分類學分析：基于Qiime平臺(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)，RDP Classifiere(version 2.2 http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier)，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平(kingdom，phylum，class，order，family，genus)統計每個樣品的群落組成。比對采用SILVA(version115 http://www.arb-silva.de)的核糖體數據庫，置信度閾值為0.7。

2 結果與討論

樣品采集完成后，經過基因組DNA的鑒定，試驗采用Tm55 ℃、25個循環確認PCR產物目的條帶大小正確、濃度合適，證明樣品合格后進行相關的后續擴增等程序。鑒定門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)5個水平的群落組成。

表1 三個階段不同微生物群落水平結果Table 1 Microbial flora level in difference fermentation stage

2.1 瀏陽豆豉釀制主要階段真菌變化情況

前期相對較少的霉菌開始在表面繁殖，從門的水平開始有所增加，綱、目的種類增加，均有接近20%的無法分類，在屬的水平大量出現了曲霉、青霉、根霉、酵母菌等，出現12個屬，尚有接近18.07%無法分類，前期制曲成熟時根霉屬占90.93%，橫梗霉屬、曲霉屬、青霉屬排其后，經過洗曲發酵3 d后大部分橫梗霉屬占優，并出現假絲酵母，洗曲的工序微生物屬有增加，堆積發酵15 d后屬類大量增加，出現絲衣霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、毛孢子菌屬、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬等，這說明在后期發酵過程中時間越長，隨著發酵體系的營養越來越豐富，代謝溫度比較適宜，微生物種類越來越多，微生物的繁殖與產品品質的關聯度值得關注。

2.2 瀏陽豆豉發酵過程中3個階段不同水平細菌的分布情況

根據瀏陽豆豉制作工藝及發酵特點，一般前期制曲為自然發酵，溫度隨季節不同進行控制，在32 ℃發酵3～7 d不等；洗曲是瀏陽豆豉制作的關鍵工序，有減少產品苦味的作用；洗曲后濾干的堆積發酵是決定風味品質的必然階段，形成產品特殊風味和藥用價值關鍵在于此。洗曲后堆積的產品品質存在一定的差異性。

可以看出，制曲發酵成熟的曲料中微生物的門水平除還有0.93%的無法確認外，主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線細菌門、變形菌門、藍細菌門等。其中厚壁菌門占87.36%。綱水平桿菌占87.26%，具有絕對優勢；依次還有放線細菌綱、變形菌綱、擬桿菌綱、產黃菌綱等共計10個綱水平(含有其他綱0.17%，未知分類0.94%)。除其他的具有0.82%外，未知的2.26%，目水平共計16種，主要包括桿菌目、乳桿菌目、微球菌目等。科的水平種類更多，達到25種，尚有其他科1.57%，未知3.59%，其主要科的比例按照含量依次為：桿菌科(62.49%)、腸球菌科(16.6%)、短桿菌科(6.65%)、金黃色葡萄球菌科(4.56%)、微球菌科(1.05%)、鏈球菌科(1.02%)等。具體到屬水平，從圖1可以看出，前期制曲完成后微生物屬種類很多，包括桿菌屬、腸球菌屬、金黃色葡萄球菌屬、短桿菌屬、乳球菌屬等，至少包括22個屬。

圖1 LY01細菌屬的水平分布餅圖Fig.1 The pie chart of LY01 bacterium abundance on genus level

從圖2可以看出瀏陽豆豉堆積發酵過程中不同微生物分類的水平差異。發酵3 d的微生物門、綱沒有發生根本變化，只是比例有所變化，但其目、科、屬的數量明顯增加，分別達到10、21、20。到目的水平與制曲成熟相比，目水平的分別是：乳桿菌目占77.82%，桿菌目為9.96%，微球菌目5.4%，腸細菌目1.98%，黃桿菌目1.17%。科的水平主要包括：腸球菌科為39.38%，明串珠菌科為21.68%，乳桿菌科14.64%，桿菌科7.36%，短桿菌科4.89%，金黃色葡萄球菌科為2.23%。

圖2 LY02細菌屬的水平分布餅圖Fig.2 The pie chart of LY02 bacterium abundance on genus level

結合圖2對比發現，經過洗曲后屬的水平發生很大變化。在屬水平上乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、微球菌屬、腸桿菌屬等比例高，這說明在后期發酵中這些微生物在品質與風味中有很重要的作用[23]。

從分析得到結果和發酵15 d的細菌屬水平圖3可以看出，這個階段除無法分類和可能存在其他類別外，門、綱、目、科、屬水平分別達到6、10、18、28、27個。堆積發酵時間延長，門的種類增加2個，綱的水平中桿菌綱占86.15%，變形菌綱占接近6%，放線菌綱2.94%，鞘氨醇桿菌綱1.56%，黃桿菌綱1.39%。桿菌目占55.28%，乳桿菌目為30.49%，兩者占目水平的絕對優勢。在科的水平上，鏈球菌科占24.39%，嗜熱放線菌科5.08%，腸膜明串珠菌科3.2%，還有大量的腸球菌科、乳桿菌科、腸桿菌科等，其比例均在1%以上。芽孢桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬、腸球菌、葡萄球菌等占比重很高，微生物種類的變化與發酵過程中微生物相互作用有關[23]。堆積發酵時間延長，細菌種類和比例有所變化，這種變化與體系發酵程度變化有關。一方面代謝不斷進行，氨基酸態氮和酸度明顯發生變化，另外就是堆積發酵溫度變化明顯，但表面與固態基質內部差異較大，這種差異對瀏陽豆豉品質會產生一定的影響。

圖3 LY03細菌屬的水平分布餅圖Fig.3 The pie chart of LY03 bacterium abundance on genus level

2.3 微生物分布

從試驗結果可知，真菌及本身根霉屬、曲霉屬、根毛霉、橫梗霉屬等類別，清洗前后差別很大，堆積發酵期間時間不同真菌差異很大，這和酵母菌大量出現有關[24]。而相對于細菌，芽孢桿菌在其中占據絕對優勢，其他乳酸桿菌、球菌、腸球菌、乳球菌、鏈球菌、桿菌等在整個發酵過程中均存在，只是所占比例差異較大，這說明細菌在瀏陽豆豉風味品質形成過程中有重要影響[25]。

2.4 微生物多樣性聚類分析heatmap圖

從圖4和圖5看，聚類分析LY01和LY02基本接近，而LY03則與其他兩個樣品差距較大，說明堆積發酵時間越長，微生物的菌相差別較大，一方面堆積時間延長，酶的水解加劇，發酵體系溫度升高，其次由于一般是敞口發酵，溫度變化導致微生物本身耐熱情況不同而出現微生物的交替變化，三是表面發酵情況與深層發酵之間具有差異性。

圖4 真菌多樣性的聚類分析熱Fig.4 Heatmap under class level of fungi diversity

圖5 細菌多樣性的聚類分析熱圖Fig.5 Heatmap under class level of bacterium diversity

真菌差異大主要是前期以根霉、曲霉、青霉為主，但洗曲后酵母菌大量出現，而細菌種類呈現多樣化，包括乳桿菌、腸桿菌等，這將對質量穩定有重要影響，因此如果作為藥用必須考慮后發酵時間與藥效之間的關聯[26-27]。

2.6 樣品中細菌群落共享和獨有的OTUs的 VEEN分析

從圖6和圖7可以看出，對于細菌數量而言，LY01、LY02、LY03三個樣品的OTU總數分別為：781、846、934；真菌數量的OTU圖分別為：55、39、91。細菌有142個OTUS是共有的，真菌只有7個。隨著發酵時間延長，細菌數量大幅度增加，而真菌則在洗曲之后稍有下降后急劇增加，這與發酵程度有關。

圖6 樣品中細菌群落共享和獨有的OTUs的 VEEN分析Fig.6 Veendiagram representation of the shared and exclusive OTUs among samples of bacterium

圖7 樣品中真菌群落共享和獨有的OTUs的VEEN分析Fig.7 Veendiagram representation of the shared and exclusive OTUs among samples of fungi

2.7 微生物多樣性稀釋性曲線

使用97%相似度的OTU利用mothur軟件做稀疏性分析，利用R語言工具制作細菌變化曲線(圖8、圖9)。

圖8 樣品中細菌變化稀釋曲線Fig.8 Bacterium changes rarefaction curve of samples

圖9 樣品中真菌變化稀釋曲線Fig.9 Fungi changes rarefaction curve of samples

LY02無論是細菌還是真菌相對來說反映的樣品信息比較有限，細菌數量變化LY01、LY03有些類似，但豐度LY03高得多。相比之下真菌的豐度均不及細菌的20%，真菌的相對豐度則LY03比LY01要多得多，堆積發酵時間對品質影響較大。

2.8 微生物樣品97%范圍內細菌和真菌多樣性變化

2.8.1 不同發酵階段細菌多樣性變化

從表2結果來看，細菌的有效讀數數量較高，其中LY01相對較少，但從H和D值來看，微生物多樣性是隨著發酵時間延長，LY03的H值最大而D值最低，說明其多樣性比前兩者均大，這說明發酵時間控制非常重要。

表2 不同發酵階段細菌多樣性變化規律(97%)Table 1 Variation within a 97% range of the bacterium diversity of the different stages

2.8.2 不同發酵階段真菌多樣性變化

從數據顯示來看，真菌的有效讀數數量堆積發酵LY02最少，堆積發酵LY03比前發酵還要多，但從H和D值來看，微生物真菌多樣性是隨著發酵時間延長而增加，LY01、LY02、LY03的H值逐步增大而D值逐漸降低。

表3 不同發酵階段真菌多樣性變化規律(97%)Table 3 Variation within a 97% range of the fungi diversity of the different stages

3 結論

從采用454高通量測序的結果來看，豆豉發酵過程中的微生物無論是細菌還是真菌均顯示了多樣性，并且有益和有害微生物均出現在微生物類別中。既有我們所需要的根霉、曲霉、毛霉、芽孢桿菌、乳酸菌等對發酵有益的微生物，但也出現了青霉、曲霉中個別屬等，可能影響產品質量和安全的微生物，這有待進一步研究。

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