Herbst矯治器與外源性PGE2對(duì)8月齡雄性比格犬髁突軟骨組織Ⅱ型膠原表達(dá)的影響

黃臻，黃根生，伍軍，桑婷

(1南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 江西省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330006；2贛州市人民醫(yī)院)

Herbst矯治器是一種固定功能矯治器，大多數(shù)學(xué)者[1,2]肯定了其對(duì)處于生長(zhǎng)發(fā)育期下頜骨發(fā)育不足的青少年有著不錯(cuò)的療效，但能否應(yīng)用于生長(zhǎng)發(fā)育晚期的患者仍然存有較大疑慮[3,4]，焦點(diǎn)集中在其對(duì)髁突生長(zhǎng)及改建的影響上。近年研究表明，膠原是顳下頜關(guān)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。其中，Ⅱ型膠原是髁突軟骨基質(zhì)的主要構(gòu)成部分，其分布能反映軟骨細(xì)胞的成熟狀況[5]。前列腺素E2(PGE2)在體內(nèi)分布廣泛，既參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，又可調(diào)節(jié)骨組織形成與改建，也能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖及膠原合成。2015年9月～2016年4月，我們采用Herbst矯治器引導(dǎo)8月齡雄性(生長(zhǎng)發(fā)育晚期)比格犬下頜前伸，并在其顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射外源性PGE2，探討其對(duì)髁突軟骨組織中Ⅱ型膠原表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 8月齡健康雄性比格犬24只(上海新岡動(dòng)物實(shí)驗(yàn)場(chǎng))，體質(zhì)量9.7～10.5 kg；Herbst矯正裝置(杭州三比公司)，鑄造夾板(南昌東森公司)，戊巴比妥鈉粉劑(美國(guó) Sigma-Aldrich公司)，Ⅱ型膠原抗體(美國(guó)Abcam公司)，DAB顯色試劑盒(福州邁新公司)，顯微鏡(日本 Olympus公司)。

1.2 動(dòng)物分組與處理 將24只比格犬按照隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，每組6只。Herbst組佩戴自制鑄造夾板式Herbst矯治器，并引導(dǎo)比格犬前伸下頜；PGE2組用無(wú)水乙醇溶解PGE2，生理鹽水稀釋至無(wú)水乙醇終濃度<0.1%，配置PGE2注射劑量[6，7]，全麻狀態(tài)下顳下頜關(guān)節(jié)注射PGE2溶液0.1 mL(含0.05 mg的PGE2)[8]；聯(lián)合組先佩戴自制Herbst矯治器，再顳下頜關(guān)節(jié)注射PGE2溶液；對(duì)照組不佩戴Herbst矯治器，與Herbst組均全麻狀態(tài)下顳下頜關(guān)節(jié)注射0.1 mL生理鹽水(含0.1%的無(wú)水乙醇)。各組均常規(guī)飼養(yǎng)60 d，其間每3天注射PGE21次。

1.3 髁突軟骨組織病理檢查及Ⅱ型膠原檢測(cè) 過(guò)量注射2%戊巴比妥鈉溶液處死比格犬，取雙側(cè)完整髁突軟骨組織，于4%多聚甲醛溶液中固定。10% EDTA脫鈣，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，沿髁突軟骨組織長(zhǎng)軸切片(厚度為4 μm)；分別進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)ABC染色，Ⅱ型膠原陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)為棕黃色染色區(qū)域。 采用光學(xué)顯微鏡圖像采集后，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析。免疫組織化學(xué)圖像以在髁突中后份選取10處500 μm×400 μm的矩形區(qū)域，以陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度的累積光密度(IOD)進(jìn)行Ⅱ型膠原半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組髁突軟骨組織形態(tài)比較 對(duì)照組比格犬髁突軟骨從表面至深層可分為纖維層、增殖層、成軟骨細(xì)胞層(過(guò)渡層)、肥大層以及鈣化軟骨層5層，各層結(jié)構(gòu)清楚，界限清晰，細(xì)胞有序排列。Herbst組、PGE2組和聯(lián)合組各層結(jié)構(gòu)清楚，成軟骨細(xì)胞層厚度均較對(duì)照組明顯增加。

2.2 各組髁突軟骨組織Ⅱ型膠原表達(dá)情況比較 Ⅱ型膠原主要表達(dá)于成軟骨細(xì)胞層和肥大層，鈣化層略有表達(dá)，而纖維層則更少。Ⅱ型膠原的表達(dá)上，聯(lián)合組陽(yáng)性表達(dá)顯著，PGE2組較活躍，Herbst組亦有表現(xiàn)，對(duì)照組則近乎缺如，棕黃染色呈遞減趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。聯(lián)合組、PGE2組、Herbst組、對(duì)照組髁突軟骨組織Ⅱ型膠原IOD分別為16 239.46±2 319.62、13 740.27±1 962.85、4 466.51±742.43、829.05±132.38，四組Ⅱ型膠原的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且聯(lián)合組>PGE2組>Herbst組>對(duì)照組(P均<0.05)。

注：箭頭指示為被染色的Ⅱ型膠原。

圖1各組髁突軟骨組織Ⅱ型膠原表達(dá)情況(免疫組化，×200)

3 討論

近年來(lái)，對(duì)Ⅱ型膠原蛋白的研究成為熱點(diǎn)。很多研究[12,13]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)髁突軟骨細(xì)胞逐步成熟時(shí)，均會(huì)出現(xiàn)Ⅱ型膠原的表達(dá)。Ⅱ型膠原作為髁突軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，構(gòu)成了其基本骨架，維持了軟骨的強(qiáng)度與生理功能，也能反映髁突軟骨生長(zhǎng)改建的活躍程度。因此，本研究將Ⅱ型膠原作為髁突軟骨成骨的檢測(cè)指標(biāo)。本研究免疫組織化學(xué)染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型膠原的表達(dá)主要在生長(zhǎng)發(fā)育晚期比格犬的成軟骨細(xì)胞層和肥大層的細(xì)胞外基質(zhì)中，鈣化層亦有表達(dá)，而纖維層幾乎沒(méi)有。半定量測(cè)量結(jié)果分析顯示，Ⅱ型膠原在對(duì)照組中極少有表達(dá)；Herbst組陽(yáng)性表達(dá)，提示Herbst矯治器的機(jī)械前伸作用可刺激生長(zhǎng)發(fā)育晚期比格犬的髁突內(nèi)Ⅱ型膠原的表達(dá)，Rabie等[12,13]的前伸裝置刺激大鼠髁突研究亦有類似的結(jié)果；PGE2組陽(yáng)性表達(dá)，提示在顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)注射一定劑量的PGE2可以促進(jìn)髁突的軟骨改建，這也與HE染色的組織學(xué)軟骨增厚相印證；聯(lián)合組強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，提示Herbst矯治器與外源性PGE2疊加運(yùn)用的效應(yīng)最大。

綜上所述，在生長(zhǎng)發(fā)育晚期的雄性比格犬佩戴Herbst矯治器和注射外源性PGE2均能促進(jìn)其髁突軟骨組織Ⅱ型膠原的表達(dá), 且二者聯(lián)合有增強(qiáng)效應(yīng)。對(duì)于外源性PGE2的不同劑量與周期對(duì)髁突Ⅱ型膠原表達(dá)的影響，有待進(jìn)一步研究。

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