胃癌細胞HGC-27與SGC-7901中基質金屬蛋白酶基因表達水平和細胞遷移能力比較

賀雄輝，鄒科見，葉木林，蔡國豪，周衛平

(海南省人民醫院，海口571001)

腫瘤細胞侵襲轉移是腫瘤惡性行為的基本特征，是促進疾病進程、復發及死亡的病理基礎，與患者的預后緊密相關。腫瘤細胞侵襲轉移是一個涉及多基因、多因素、多步驟的復雜過程，要明確其中的具體機制是一項浩大工程。目前認為，細胞外基質(ECM)及基底膜的降解是腫瘤細胞發生侵襲轉移過程中的關鍵環節[1]。基質金屬蛋白酶(MMPs)是降解ECM及基底膜的主要酶類，其中MMP-2和MMP-9是其家族中具有代表性的兩種酶。既往研究[2]顯示，二者表達水平有助于預測腫瘤轉移的風險及預后。HGC-27和SGC-7901是兩種惡性程度不同的胃癌細胞株，前者為未分化胃黏液腺癌，后者為淋巴結轉移的胃腺癌[3]。一般腫瘤細胞分化程度越低，惡性程度越高。2013年4月～2017年2月，我們對比觀察了HGC-27和SGC-7901細胞中MMP-2和MMP-9表達水平及細胞遷移能力，分析胃癌轉移的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HGC-27和SGC-7901細胞由海南省人民醫院公共實驗室保存；標準胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；MMP-2和MMP-9 RT-PCR反應試劑購自美國Fermentas公司；Metrigel Matrix基質凝膠購自美國BD公司；Bio Coat Matrigel侵襲小室購自美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胃癌細胞培養 將HGC-27和SGC-7901細胞接種于RPMI1640培養液中(內含10%胎牛血清+青霉素100 U/mL+慶大霉素100 U/mL)，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養，以0.25%胰蛋白酶按1∶3消化傳代。

1.2.2 胃癌細胞中MMP-2、MMP-9 mRNA檢測 采用RT-PCR法。提取細胞RNA，電泳檢測RNA提取質量；將RNA逆轉錄成cDNA，采用PCR法檢測細胞中MMP-2、MMP-9 mRNA水平。引物序列：內參GAPDH上游為5′-TAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3′，下游為5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′；MMP-2上游為5′-ATCCCATGATGACATCAA-3′，下游為5′-AGCAGCCCAGCCAGTCTGAT-3′；MMP-9上游為5′-CTTAGATCATTCTTCAGTGCC-3′，下游為5′-GATCCACCTTCTGAGACTTCA-3′。擴增條件：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40個循環。3次獨立實驗后得到的數據，以2-ΔΔCT計算MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達量。

1.2.3 胃癌細胞遷移能力觀察 采用Transwell侵襲小室。上、下室間孔徑直徑為8 μm，上鋪Metrigel Matrix基質凝膠。在其上室加入100 μL培養液，下室加入600 μL培養液(內含10%胎牛血清)；取30 μL細胞懸液加入上室，放入CO2孵箱培養24 h。用甲醇固定，0.2%結晶紫染色；在顯微鏡下觀察每張濾膜10個不重復的視野，計算每個視野中穿透Metrigel Matrix基質凝膠的細胞數，重復3次取其平均值。

2 結果

2.1 不同胃癌細胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平比較 HGC-27中的MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平高于SGC-7901，差異有統計學意義(P均<0.01)。見表1。

表1 胃癌HGC-27和SGC-7901細胞中MMP-2、 MMP-9 mRNA相對表達量比較

注：與SGC-7901細胞比較，*P<0.01。

2.2 不同胃癌細胞遷移能力比較 HGC-27穿膜細胞數為(145.89±12.23)個，高于SGC-7901的(70.54±2.37)個(P<0.01)。

2.3 胃癌細胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平與細胞遷移能力的關系 相關性分析顯示，胃癌細胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表達與穿膜細胞數呈正相關(r分別為0.675、0.463，P均<0.01)。

3 討論

腫瘤細胞的體外增殖能力、運動能力、同質黏附能力、異質黏附能力、侵襲轉移能力、血管形成能力、體內成瘤能力及軟瓊脂克隆形成能力等是腫瘤的主要惡性表型，其中侵襲轉移能力十分重要[4～6]。腫瘤細胞侵襲轉移的過程大致為：首先細胞從母體脫離向基質侵入，黏附在基底膜上，經過水解酶的作用，將具有抑制其遷移的基底膜及ECM降解，然后錨定一些繼發組織或器官，最終形成轉移病灶。因此，降解ECM和基底膜是遷移過程中的重要步驟，以利于腫瘤細胞轉移與擴散。

MMPs是一類能破壞組織結構及基底膜的蛋白水解酶大家族，迄今為止發現的相關酶類不下20種。其中，MMP-2、MMP-9屬于明膠酶類，能夠降解基膜的主要成分Ⅳ型膠原，在機體炎癥、新生血管形成及腫瘤轉移等生物學行為發生過程中發揮重要作用[7]，目前已成為腫瘤侵襲轉移研究中的熱點。既往已有多項研究表明二者與腫瘤有關，包括腫瘤的分級、分期、淋巴結轉移及脈管浸潤等。M?kinen等[8]研究發現，腫瘤TNM分期越高、伴有淋巴結轉移，那么對應的MMP-2和MMP-9蛋白表達水平也就越高，提示惡性程度越高的腫瘤MMP-2和MMP-9蛋白表達水平越高。HGC-27細胞株屬于未分化胃黏液腺癌，惡性程度高于SGC-7901。本研究結果顯示，HGC-27細胞中MMP-2、MMP-9 mRNA水平明顯高于SGC-7901，與侯曉麗等[9]研究相符，進一步證明了腫瘤惡性程度與MMP-2、MMP-9表達水平呈正相關。

目前，多數研究是通過分析MMP-2、MMP-9表達與患者臨床病理特征的相關性來推測其與腫瘤轉移的關系。馮寧等[10]研究發現，MMP-2 蛋白與胃癌遠處轉移有關，而 MMP-9蛋白與胃癌的分化及腫瘤浸潤有關；陳友權等[11]研究發現，MMP-2與MMP-9參與胃癌的浸潤與轉移，其機制可能與趨化因子 SDF-1 及其受體 CXCR4 軸的作用有關。而本研究通過Transwell侵襲小室模型檢測穿膜細胞數來反映其體外侵襲轉移能力，客觀性更強；穿膜細胞數越多，腫瘤細胞的侵襲轉移能力越強[12，13]。本研究結果顯示，HGC-27細胞的穿膜細胞數較SGC-7901明顯增多，說明HGC-27細胞的侵襲遷移能力更強。不難理解，高表達的MMP-2、MMP-9更能降解ECM和基底膜，破壞腫瘤細胞轉移的屏障，從而為腫瘤細胞的轉移提供了可能，尤其是惡性程度越高的腫瘤[14，15]。

綜上所述，與SGC-7901細胞比較，HGC-27細胞穿膜細胞數更多、侵襲轉移能力更強，其機制可能與MMP-2與MMP-9高表達有關。這提示通過抑制MMPs功能或阻斷 MMPs 合成的信號通路，可成為胃癌治療的一個靶點。

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