川芎嗪對兔良性膽管狹窄成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)代謝的影響

李克躍，石承先，湯可立，魏國微，劉振華，黎濤，張帥民，徐賢剛

(貴州省人民醫(yī)院，貴陽550002)

良性膽管狹窄(BBS)是由于肝移植、膽管炎反復(fù)發(fā)作、膽管損傷等疾病引起的膽管腔瘢痕性縮窄[1～4]，增生性瘢痕(HS)形成是其目前比較認(rèn)可的直接原因。成纖維細(xì)胞等組織修復(fù)細(xì)胞過度增殖及Ⅰ型膠原(col-Ⅰ)等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積是瘢痕的兩大特征，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1) 及基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)在膽管HS形成過程中發(fā)揮了重要作用[5～7]。我們前期的研究提示，川芎嗪(TMP)在抑制BBS形成過程中可能發(fā)揮重要作用[8, 9]，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。2016年8月～2017年2月，我們用TMP干預(yù)BBS膽管成纖維細(xì)胞(MF)，觀察其對MF細(xì)胞增殖及col-Ⅰ、MMP-9 、TIMP-1表達(dá)的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 家兔4只(貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；注射用鹽酸TMP(北京四環(huán)科寶制藥有限公司)；抗MMP9單克隆抗體(Abcam公司)；抗細(xì)胞角蛋白、col-Ⅰ、波形蛋白單克隆抗體及聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Sigma公司)； SYBR?Premix Ex TaqTM(大連寶生物工程有限公司)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(Millipore公司)；抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)； DAPI(Roche公司)；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、基因引物、TRIzol、0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素溶液、CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)盒、DMEM、全蛋白提取試劑盒、FBS、氯仿(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BBS模型建立與MF的獲取、鑒定 采用切開再吻合方法[7]建立兔BBS模型，術(shù)后1周取膽管壁，無菌PBS清洗后修剪成2～3 mm3大小；轉(zhuǎn)移組織到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中干燥貼壁4～6 h；加入少量含有20% FBS、100 U/mL 青霉素及100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)[8, 9]，細(xì)胞融合至 90%左右時(shí)傳代。取第3～5代細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫熒光法檢測細(xì)胞角蛋白及波形蛋白抗體進(jìn)行細(xì)胞鑒定[9]。免疫熒光染色后波形蛋白陽性染色、角蛋白陰性染色，符合成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 將MF細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，用胰酶消化后接種于6或96孔板，2×104/孔(96孔板，細(xì)胞增殖測定用) 或2×105/孔(6孔板，基因或蛋白測定用)；含10% FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6 h，改為不含 FBS的培養(yǎng)基饑餓過夜；觀察組分別給予0.04、0.2、1.0 mg/mL的TMP處理，對照組不處理，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。兩組按照每孔10 μL加入CCK-8試劑培養(yǎng)2.5 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長時(shí)的光密度(OD)值，用扣除本底的方法來消除誤差，以此表示細(xì)胞增殖情況。

1.2.4 細(xì)胞中col-Ⅰ、MMP-9、TIMP-1 mRNA檢測 采用Real-time PCR法。取兩組細(xì)胞，用TRIzol總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，將純度好、完整性高的RNA合成cDNA。col-Ⅰ上游引物為5′-AGAACGGAGATGACGGAGAA-3′，下游引物為5′-CCAAACCACTGAAACCTCTGT-3′；MMP-9上游引物為5′-CAACTTTGACAGCGACAAGAAG-3′，下游引物為5′-CTAGGTAGCGGTACATGGGGTA-3′；TIMP-1上游引物為5′-GGGCTCCAGAAGTCAATCATAC-3′，下游引物為5′-GTTGTCCAGCGATGAGAAACTC-3′；β-actin上游引物為5′-CTCTCCACCTTCCAGCAGAT-3′，下游引物為5′-TGGCTCTAACAGTCCGCCTA-3′。反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBRR Premix 10 μL、上下游引物各0.8 μL、雙蒸水6 μL、ROX Reference Dye(50)0.4 μL、樣品 cDNA 2 μL，重復(fù) 4次。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，按照95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s進(jìn)行40 個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)。ABI Stepone實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng)采集并分析結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞增殖情況比較 觀察組予0.04、0.2、1.0 mg/mL的TMP處理48 h時(shí)的OD值分別為0.505±0.005、0.466±0.004、0.406±0.003，均低于對照組的0.532±0.004(P均<0.05)。

2.2 兩組細(xì)胞col-Ⅰ、MMP9、TIMP-1 mRNA表達(dá)比較 觀察組予0.2、1.0 mg/mL的TMP處理48 h時(shí)，其col-Ⅰ、TIMP-1 mRNA的相對表達(dá)量低于對照組(P均<0.05)，MMP-9 mRNA相對表達(dá)量高于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細(xì)胞colⅠ、MMP-9、TIMP-1 mRNA表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

損傷修復(fù)過程中，不可避免地會(huì)形成不同程度的增生性瘢痕[10]。組織可自行通過塑形糾正輕微的瘢痕，但難以矯正過多的瘢痕。膽管增生性瘢痕的形成，常伴隨著較高的BBS發(fā)病率。

成纖維細(xì)胞是組織損傷修復(fù)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，在組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。組織損傷后，成纖維細(xì)胞大量增殖，同時(shí)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，分泌大量的ECM及細(xì)胞因子促進(jìn)組織修復(fù)。肌成纖維細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的特點(diǎn)，具有較強(qiáng)的收縮性。正常情況下，一旦創(chuàng)面完全表皮化后，成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞就減慢增殖速度，同時(shí)也減少ECM的分泌，組織修復(fù)過程趨于停止；病理情況下，成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞增殖過度，ECM積聚過多，則形成增生性瘢痕[11]。成纖維細(xì)胞也是膽管瘢痕修復(fù)及BBS形成的主要效應(yīng)細(xì)胞[7, 12]。

ECM是由動(dòng)物細(xì)胞合成并分泌到胞外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，大致分為4類，即非膠原糖蛋白、膠原、蛋白聚糖與氨基聚糖以及彈性蛋白。ECM對細(xì)胞的形狀、結(jié)構(gòu)、增殖、分化等生命現(xiàn)象具有全面的影響，它在所有生理活動(dòng)中均具有重要的作用。研究[7, 12]發(fā)現(xiàn)，ECM尤其是col-Ⅰ過度沉積是瘢痕及膽管瘢痕的主要生物學(xué)特征之一。ECM的代謝主要受到MMPs及TIMPs的調(diào)控。MMPs家族根據(jù)結(jié)構(gòu)和降解底物分為明膠酶、膠原酶、基質(zhì)水解酶、膜型和其他基質(zhì)金屬蛋白酶，它們參與除多糖以外的全部ECM的降解，在組織修復(fù)、塑形、瘢痕的形成過程中發(fā)揮著重要作用，其中以MMP-2及MMP-9研究最多。TIMPs包括4種異構(gòu)體，即TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3及TIMP-4，其中TIMP-1及TIMP-2是MMPs的主要調(diào)控因子。正常情況下，TIMPs及MMPs能維持ECM的代謝平衡；異常情況下，TIMPs及MMPs表達(dá)異常，導(dǎo)致ECM大量積聚，形成增生性瘢痕。MMPs及TIMPs的表達(dá)主要受到轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的調(diào)控。然而，有關(guān)MMPs及TIMPs具體是如何調(diào)控瘢痕組織中的ECM代謝的，目前依然知之甚少。有研究[13]顯示，TIMP-1傾向于抑制MMP-9的表達(dá)，TIMP-2及TIMP-4傾向于抑制MMP-2的表達(dá)，而TIMP-3傾向于抑制MMP-2及MMP-9的表達(dá)。另有研究[14, 15]顯示，MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9及它們的抑制劑TIMP-1、TIMP-2在肝內(nèi)膽管系統(tǒng)也有表達(dá)，提示MMPs及TIMPs在膽管瘢痕修復(fù)及BBS行程過程中可能也發(fā)揮了重要作用。

TMP具有免疫抗腫瘤、抗氧自由基、抗組織纖維化、改變血液流變學(xué)等功效，尤其是抗纖維化作用備受關(guān)注。我們前期研究提示，TMP能夠調(diào)控BBS模型MF中P311/TGF-β1/α平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)通路的表達(dá)，也能調(diào)控腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)MF中P311/TGF-β1/α-SMA通路的表達(dá)，提示TMP可能在抑制BBS形成過程中發(fā)揮了重要作用[8, 9]。本研究結(jié)果顯示，適當(dāng)濃度的TMP能下調(diào)BBS模型MF中col-Ⅰ及TIMP-1 mRNA的表達(dá)，上調(diào)MMP-9 mRNA表達(dá)，從而抑制MF細(xì)胞增殖，且濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。因此，我們認(rèn)為TMP抑制BBS形成的機(jī)制可能與其調(diào)控MF中ECM的代謝有關(guān)。

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