基于生物信息學的胃腺癌組織中miRNA差異表達分析及其臨床意義

趙蘭，何林秀，江龍洋，王昕楠，魏敏杰，趙琳

(中國醫科大學藥學院，沈陽110122)

胃癌是消化道常見惡性腫瘤之一[1]，發病率在我國各種惡性腫瘤中居首位，嚴重危害人類健康[2]。胃癌發病有明顯的地域性差別，在我國的西北與東部沿海地區其發病率比南方地區明顯增高[3]。胃癌好發年齡在50歲以上，男女發病率約為2∶1[4]。胃腺癌是胃癌的一種，由胃腺體細胞惡變而來，其發生率占胃惡性腫瘤的95%。從分子水平研究胃腺癌發生發展的機制有利于發現新的分子靶點，提供新的治療手段[5]。近年來，胃腺癌預后的基礎研究和臨床實踐一直是研究的難點和熱點[6]，其預后有關的標記物更是如此。胃腺癌的預后與胃癌的病理分期、部位、組織類型、生物學行為以及治療措施等因素有關[7]。微小RNA(miRNA)可影響腫瘤的發生、侵襲以及轉移等過程，它們可以通過調控靶基因參與相關的信號通路，進而發揮與癌基因或是抑癌基因類似的作用[8]。但是，哪些miRNA在胃腺癌組織中存在異常表達，是否可成為胃腺癌生物標記物，目前尚不清楚。2017年4～10月，我們通過癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫，深入分析miRNA在胃腺癌組織中的差異性表達，并篩選可作為胃腺癌生物標記物的miRNA。

1 材料與方法

1.1 胃腺癌組織中差異表達miRNA的篩選 組織樣本來源于TCGA(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)，下載并預處理胃腺癌相關數據集的miRNA表達資料，篩選出差異表達基因(DEGs)，閾值設為FDR<0.05，差異表達倍數(FC)>1或<-1。本次研究包含45份正常組織和446份胃腺癌組織樣本。

1.2 胃腺癌組織中高表達、預后差miRNA的篩選 用R語言程序包(edgeR包)繪制出熱圖和火山圖，在安裝Survival包的條件下，利用Kaplan-Meier法進行生存分析，篩選出高表達與低表達時生存率差異明顯，并且在高表達時預后差的miRNA。

1.3 胃腺癌中高表達、預后差miRNA的靶基因預測與富集分析 ①繪制miRNA維恩圖取交集：利用在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將Targetscan網站(http://www.targetscan.org/vert_71/)和miRDB(http://www.miRdb.org/)網站中得出的靶基因取交集，提高準確率，縮小范圍。它將生成一個文本輸出，指示每個交集中哪些元素或某個列表是惟一的。 如果列表數目低于7，它還將以Venn/Euler圖的形式生成圖形。 我們可以選擇對稱(默認)或非對稱維恩圖，計算最多30個列表的交點。圖形輸出以SVG和PNG格式生成。②miRNA靶基因富集分析：利用在線網站DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(GO)分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)分析，以判定差異基因主要影響的生物學功能或者通路。

2 結果

2.1 胃腺癌組織中差異表達miRNA的篩選結果 利用TCGA數據庫在45份正常組織和446份胃腺癌組織樣本中篩選出319個差異表達miRNA，其中下調95個、上調224個。圖1是491個樣本和DEGs雙向分層聚類的結果，橫坐標代表樣本的名稱，縱坐標代表發現的差異miRNA，差異表達的miRNA以不同顏色劃分，深色表示基因表達上調，淺色表示基因表達下調。由聚類分析圖(圖2)可見，腫瘤和正常組織形成了明顯的聚類群，層次聚類分析顯示，組內數據關系接近，基因表達存在著明顯不同的聚類，可以很好地區分正常組織與癌組織這兩組樣本。

2.2 胃腺癌組織中高表達、預后差的miRNA篩選結果 根據TCGA數據庫得到的224個上調miRNA中篩選出6種高表達且與預后有關的miRNA(P均<0.05)，即miR-217、miR-216a、miR-200b、miR-1911、miR-675、miR-96。見表1。對以上列表中的miRNA作Kaplan-Meier生存曲線，其中miR-216a、miR-217高表達者預后差。綜合P值和生存曲線，在以下分析中，我們主要關注miR-217進行研究。

圖1 DEGs在各樣本中的表達

圖2 差異基因火山圖

miRNALogFCPmiR?2171．6887650．01821miR?216a1．1071390．03071miR?200b1．6719290．04564miR?19113．0849450．04666miR?6751．9620220．03696miR?961．6719290．03195

2.3 胃腺癌組織中miR-217表達變化及其靶基因分析結果 胃腺癌組織中miR-217表達量為303.2±55.16，高于正常組織中的84.82±13.42(P<0.001)。通過Targetscan網站在線預測miR-217的下游靶基因，得到449個有效基因；同時在miRDB網站預測靶基因，得到380個基因；將兩者取交集，得到151個基因。通路富集分析發現，miR-217的靶基因與調節細胞凋亡、細胞周期、大分子代謝和蛋白酶的活性密切相關(圖3)。

3 討論

在本研究中，利用TCGA數據庫一共篩選出了319個差異表達miRNA，其中下調95個、上調224個。在224個上調miRNA中逐一篩選出6個與預后有關，根據其P值與生存曲線挑選出最具潛在生物標記物性質的miRNA為miR-217，并針對miR-217進行后續研究，分析miR-217在正常組織與胃腺癌組織中的差異表達，預測miR-217的靶基因，并對這些靶基因的功能進行富集分析，得到了miR-217的差異靶基因與調節細胞凋亡，細胞周期，大分子代謝和蛋白酶的活性密切相關。

圖3 miR-217靶基因功能的GO和KEGG分析

miRNA是長度為21～25個堿基的內源性單鏈小分子RNA，可通過與mRNA特異性的結合降解或抑制mRNA的蛋白質翻譯來調控靶基因的表達。miR-217可能在腫瘤轉移中發揮重要作用，但研究表明miR-217在不同的惡性腫瘤中所發揮的功能不一致[9～11]。miR-217能夠靶向K-RAS抑制胰腺癌生長[12]，miR-217還能夠靶向核轉錄因子E2F3抑制肝癌轉移[13]，也有研究發現miR-217具有促癌作用[14]。但是，miR-217在胃腺癌中發揮的作用還沒有過系統的研究。目前，生物信息學預測和計算機技術在腫瘤研究的各個方面有了很好的應用，包括芯片分析和RNA測序在內的高通量分析篩選，讓研究者獲得很多關于基因表達的數據，并篩選出在腫瘤檢測和靶向治療方面發揮作用的新的腫瘤生物標記物。

本研究采用生物信息學方法探討miR-217在胃腺癌中的表達及其臨床意義，它是以更新穎的方法研究胃腺癌可能的發病機制與潛在的預后標記物，不僅補充了我們對胃癌以往發病機制的認識，還為今后的研究提供了基礎。我們通過利用TCGA中胃腺癌的數據集，收集胃腺癌相關基因芯片數據，將腫瘤組織與正常組織樣本數據進行對比分析，篩選與胃腺癌發生相關的miRNA標志物。miR-217在胃腺癌組織中高表達，且在Kaplan-Meier預后生存曲線分析結果顯示，miR-217高表達提示預后差。這提示檢測胃腺癌組織中miR-217的表達有重要的臨床意義。

細胞凋亡是指有核細胞在一定條件下通過啟動其自身內部遺傳機制, 主要通過內源性DNA內切酶的激活而發生的細胞自然死亡過程 ，也有人稱之為程序性死亡(PCD)，與Caspase、Bcl-2家族蛋白密切相關[15]。生物的生長發育需要對細胞周期進行精確協調的時空調控。近年來,以細胞周期蛋白(Cyclin)-細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)為中心的細胞周期分子調控機制已經確立并取得了很大進展，即Cyclin與CDK結合后通過磷酸化調節一系列靶分子,這些下游分子激發一系列下游事件的貫序發生,最終導致DNA的復制和有絲分裂,使細胞周期嚴格按照G1、S、G2、M循環運轉[16]。本研究發現，miR-217的差異靶基因與調節細胞凋亡、細胞周期、大分子代謝、蛋白酶的活性密切相關，提示miR-217可能通過調控上述途徑參與腫瘤的發生發展，但是具體分子機制有待更深入的研究。

綜上所述，與正常組織比較，胃腺癌組織中存在miRNA的差異表達，一些信號傳導途徑、相互作用分子可能參與胃腺癌的發生發展。其中，miR-217是與胃腺癌預后相關的關鍵基因，miR-217表達越高，患者預后越差，并與PCD、細胞周期密切相關，繼續對這些差異表達的基因研究將為胃腺癌的基礎研究和臨床實踐提供理論指導。

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