瑞戈非尼對裸鼠皮下肝癌移植瘤生長及生物鐘基因表達的影響

何曉曉，熊枝繁，邱夢君，占靜，陳仁旺，楊盛力

(1華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院，武漢430077；2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院)

瑞戈非尼是一種口服多激酶抑制劑，做為新型的小分子靶向藥物，在前期的動物實驗和Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗中均表現出良好的療效和耐受性[1]。2017年4月27日，經美國食品藥品監督管理局批準用于經過索拉非尼治療但疾病仍出現進展的肝細胞癌(簡稱肝癌)患者。至此，瑞戈非尼開始作為二線治療藥物用于肝癌的治療。生物鐘是生物體內在的自主調節器，能夠維持機體每天的睡眠-覺醒、代謝、激素分泌和細胞周期，以保持機體適當的生理節律[2，3]。其在分子水平上受Per1、Per2、Per3、CLOCK、BMAL1、CCry1、Cry2、BMAL1、NPAS2、DEC和CKIε等多個生物鐘基因調控[4]。目前研究[5]表明，生物鐘基因的表達異常在實質性的腹部惡性腫瘤中普遍存在；另有研究[6]證實，生物鐘基因的突變、缺失以及表達的異常與肝癌的發生和發展均具有密切的相關性。瑞戈非尼在治療肝癌的同時是否對生物鐘基因的表達產生影響，目前尚無研究。2017年3～4月，我們建立了裸鼠皮下肝癌移植瘤模型，擬在驗證瑞戈非尼對肝癌療效的同時，探討該藥對肝癌組織生物鐘基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HepG2細胞，購自中國典型物種保藏中心；清潔級BALB/C-nu系裸鼠，雌雄各半，4～6周齡，體質量14～20 g；RPMI1640培養基、FBS、胰酶購于Hyclone公司；DMSO 購于MP公司；生物鐘基因及內參PCR引物由Life公司合成；RNA提取試劑TRIzol和PCR試劑SYBR?Green PCR Master Mix購于Life公司；瑞戈非尼片，由德國Bayer公司(West Haven，CT)生產，40 mg/片，溶解于100% DMSO，藥物終濃度為100 mg/mL。

1.2 模型建立與分組處理 取對數生長期的HepG2細胞，用含10% FBS的RPMI1640培養基將其輕輕吹打成均勻的細胞懸液，用PBS稀釋到1×107/mL。取裸鼠16只，消毒裸鼠皮膚；用1 mL注射器向裸鼠右側腋窩處皮下注入HepG2細胞懸液 0.2 mL，觀察接種部位液體吸收及成瘤情況。接種3 d后，在裸鼠右側腋窩皮下注射部位處，均觸及直徑3～4 mm腫瘤結節，致瘤成功率達到100%。1周后根據成瘤情況將裸鼠隨機分為兩組，每組8只。實驗組和對照組分別給予瑞戈非尼20 mg/kg、DMSO 100 μL/20 g灌胃，每天1次，連續給藥2周。

1.3 裸鼠一般情況及移植瘤生長情況觀察 給藥期間，觀察裸鼠一般情況，每隔2 d測量并計算腫瘤體積；制出每組裸鼠皮下肝癌移植瘤生長曲線，比較兩組生長速度。游標卡尺測量腫瘤結節的最長徑(a)和最短徑(b)，按公式 V=ab2/2 計算腫瘤體積。

1.4 肝癌細胞中生物鐘基因檢測 采用Real-time PCR法。2周后頸椎脫臼法處死裸鼠，切取剝離瘤體，凍存于液氮中備用。取兩組凍存腫瘤組織各100 mg，根據TRIzol使用說明提取細胞總RNA，檢測RNA 濃度和純度。取相同量的mRNA逆轉錄cDNA，根據SYBR?Green PCR Master Mix(2×)進行定量PCR反應，每個樣本設3個復孔。總反應體系為20 μL：SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 模板1.5 μL，10 μmol/L的上游和下游引物各1 μL，dd H2O 6.5 μL。以 β-actin 作為內參基因，以2-ΔΔCt表示基因相對表達量。生物鐘基因、內參基因引物及熔解溫度、產物大小，見表 1。

表1 生物鐘及內參基因引物

2 結果

2.1 兩組裸鼠一般情況比較 治療前后，兩組裸鼠存活良好，均未出現死亡。隨著瘤體的增大，裸鼠腋下脂肪逐漸減少，食欲較前下降，出現精神不振、行動遲緩。相較于對照組，實驗組裸鼠精神、行動較前無明顯變化，飲食水量、體質量較前均有所下降。

2.2 兩組給藥不同時點裸鼠皮下肝癌移植瘤生長情況比較 與對照組比較，實驗組瘤體生長速度緩慢，第3～15天瘤體體積有減小趨勢(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組給藥不同時點裸鼠皮下肝癌移植瘤生長情況比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組裸鼠裸鼠皮下肝癌移植瘤組織中生物鐘基因表達比較 與對照組比較，實驗組裸鼠裸鼠皮下肝癌移植瘤組織中Per2、Per3、Cry1、Cry2基因表達升高，BMAL1基因表達下降，差異均具有統計學意義(P均<0.05)，Per1、CKIε和CLOCK基因表達兩組間差異無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 兩組裸鼠裸鼠皮下肝癌移植瘤組織中生物鐘基因表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

HCC是一種全球范圍內的惡性腫瘤，具有高發病率和高病死率的特點。研究[7～9]表明，HCC的發生、發展與多種生物鐘基因表達紊亂相關。本課題組的前期研究也發現，與癌旁組織相比，肝癌組織中生物鐘基因Per1、Per2、Per3、CLOCK、BMAL1、Cry1、Cry2和CKIε的mRNA表達水平均明顯降低[10]。

瑞戈非尼作為一種新型口服多靶點磷酸激酶抑制劑，其靶向作用于血管生成(血管內皮生長因子受體1～3、表皮生長因子同源結構域酪氨酸激酶2等)、基質相關受體(血小板衍生生長因子受體β、成纖維細胞生長因子受體等)和致癌受體酪氨酸激酶(KIT、RET和RAF等)相關因子[11]。2017年5月6日，瑞戈非尼(拜萬戈)在中國正式上市，被允許作為二線用藥應用于索拉非尼治療失敗的中晚期HCC患者，其良好的療效和耐受性在前期的臨床試驗中得到了驗證[12]。

既往研究[13]表明，生物鐘基因能影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、細胞周期的調控，在DNA損傷反應以及化療藥物的治療反應中均起到重要作用。因此，瑞戈非尼在治療HCC的過程中是否會影響到腫瘤細胞生物鐘基因的表達進而對其臨床療效產生影響，是目前亟待研究的一個重要課題。本實驗將人肝癌HepG2細胞接種于裸鼠腋窩皮下，成功建立了裸鼠皮下肝癌移植瘤模型，給予瑞戈非尼灌胃治療2周后發現明顯抑制瘤體的生長。為了驗證瑞戈非尼能否影響生物鐘基因的表達，我們利用Real-time PCR技術檢測了肝癌細胞中生物鐘基因Per1-3、CLOCK、BMAL1、CKIε和Cry1-2的表達情況，實驗結果顯示，與對照組相比，瑞戈替尼治療后能明顯上調肝癌組織中Per2、Per3、Cry1和Cry2 mRNA的表達，并下調BMAL1 mRNA的表達水平。

目前多項研究結果[13～15]均發現, 生物鐘基因Per1～3是一種潛在的抑癌基因，它能夠抑制腫瘤細胞的生長和增殖，誘導細胞凋亡，在腫瘤細胞中普遍呈現低表達狀態。有研究[10,16]證實，Cry1～2基因在腫瘤組織中也呈現低表達狀態，生物鐘基因Cry2的突變和缺失能夠增加小鼠肝癌的發生率。本研究結果證實了瑞戈非尼對生物鐘基因表達的影響，這說明該藥除了能夠阻斷涉及腫瘤生長和進展過程中的多種磷酸激酶，達到治療肝癌的作用外，還有望通過改善生物鐘基因紊亂，上調潛在抑癌基因Per和Cry的表達，來抑制腫瘤的生長和疾病進展。但是，一項最新研究[17]表明，BMAL1過表達能夠抑制腫瘤發生，并且增加對化療藥物的敏感性，因此瑞戈非尼對BMAL1表達的下調作用可能會對該藥療效產生負面影響。為進一步明確瑞戈非尼能否通過改變生物鐘基因表達這一途徑影響其治療HCC的藥理作用，接下來我們將從蛋白水平驗證瑞戈非尼治療后生物鐘基因的表達變化，并進一步探討該藥影響肝癌細胞生物鐘基因表達改變的信號通路，以期為該藥的臨床應用提供更多的理論依據。

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