硼酸鈉對人肝癌細胞HepG2內質網應激蛋白Grp78和CHOP表達的影響

王生，武倫，魏英，魏廣民，張有順，袁方均

(湖北醫藥學院附屬東風醫院，湖北十堰442000)

在中國，每年超過35萬人被診斷為肝細胞癌(HCC)，約占全球新診斷HCC的一半。多數HCC患者在明確診斷后已失去手術切除病灶的機會,因此研發高效、低毒的HCC治療藥物非常重要。硼作為人體一種營養必須元素，具有重要生理功能。它可參與能量代謝、胰島素釋放及免疫系統等功能的調節[1, 2]，甚至還具有改善關節炎、血漿脂質水平和腦功能的重要作用。硼在生理濃度下無突變致癌效應，且不具有基因毒性，主要通過胃腸組織上皮細胞和黏膜吸收[3]。最新研究發現，硼對宮頸癌、前列腺癌、乳腺癌等均有抑制作用[4～6]。在肝臟疾病相關研究中，已證實硼在四氯化碳誘導肝臟損傷的小鼠模型體內具有較好的護肝作用[7]；硼中子俘獲治療 (BNCT)具有選擇性殺傷正常組織內癌細胞的能力，并進行了治療肝臟惡性腫瘤的嘗試[8]；硼還能通過抑制應激反應緩解暴發性肝衰竭，并從病理學層面延緩肝癌進展[9]。因此，硼對HCC的發生發展具有積極的預防作用。本課題組前期研究已表明，硼的化合物硼酸鈉(Borax)可通過線粒體途徑活化p53誘導HCC細胞凋亡[10]，但從不同方向探討Borax促進HCC細胞凋亡的作用機制具有重要意義。2016年7月～2017年5月，我們觀察了Borax對人HCC細胞HepG2內質網應激(ERS)蛋白葡萄糖調節蛋白78(Grp78)及下游靶基因C/EBP家族同源蛋白(CHOP)表達的影響，在ERS層面探討Borax誘導HCC細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及試劑 人HCC細胞株 HepG2 (武漢大學典型培養物保藏中心)；Borax (天津博迪化工股份有限公司)；DMEM高糖培養液(美國Hyclone公司)；10%胎牛血清 (天杭生物科技有限公司)；TRIzol Reagent(美國Incitrogen公司)；逆轉錄試劑盒 (美國 Fermentas 公司)；PCR引物(上海生工生物有限公司設計并合成)；PCR試劑盒；兔抗人Grp78抗體、兔抗人CHOP抗體、小鼠抗人GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(美國GeneTex公司)。

1.1.2 主要實驗儀器 CO2培養箱(法國 Thermo 公司)；IX71 熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；熒光定量PCR儀(澳大利亞 RotorGene公司) ；電泳儀和半干轉膜儀(美國Hoefer Inc公司)，UPV INC凝膠成像系統(中國香港 Gene 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組處理 用含 10% 胎牛血清的DMEM培養液，在37 ℃、5% CO2條件下常規培養HepG2，每2天換液1次；當細胞覆蓋80%～90%瓶底后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化傳代。將1×105/mL的HepG2細胞懸液接種于12孔板(1 mL/孔)，隨機分為兩組。觀察組用0.1 mmol/L Borax處理，對照組未經Borax處理，每組設置3個復孔。

1.2.2 細胞中Grp78、CHOP mRNA檢測 采用qRT-PCR 法。取對照組和觀察組Borax作用1、2、3、4 h的細胞，應用TRIzol 總RNA提取純化試劑盒抽提細胞RNA，紫外分光光度儀測定A260與 A280比值在1.8～2.0。應用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，在稀釋至7 ng/μL的cDNA中加入SYB-GREEN PCR Master Mix和相應基因擴增引物。Grp78上游引物5′-TTTCACAGTGCCCAAGAGTG-3′、下游引物5′-TGATCACTCACTCCCCATCA-3′；CHOP上游引物5′-GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3′、下游引物5′-CCAATTGTTCATGCTTGGTG-3′。反應條件: 94 ℃ 5 min，60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共35個循環。以目的基因域循環數(Ct) 值，對同一樣本的內參照基因GAPDH Ct值進行目的基因表達的相對定量分析。

1.2.3 細胞中Grp78、CHOP 蛋白檢測 采用免疫印跡法。取對照組和觀察組Borax作用1、2、3、4 h的細胞，收集細胞于1.5 mL EP管中；4 ℃下1 500 r/min離心5 min，棄培養液后用預冷PBS洗滌細胞3次；加入細胞裂解混合液(細胞裂解液1 000 μL、磷酸酶抑制劑10 μL、蛋白酶抑制劑1 μL、PMSF 10 μL),置于4 ℃搖床劇烈震蕩30 s，放置冰上4 min，重復5次。之后，4 ℃下12 000 r/min離心 5 min，取上清全蛋白提取物，用BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣本蛋白濃度。變性后取30 μg總蛋白，選擇10%分離膠進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠45 V、分離膠55 V，4 h)。電泳完畢后，將總蛋白用半干轉膜儀電轉至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉PVDF膜，室溫孵育1 h；分別加用TBST稀釋1∶1 000的一抗(Grp78、CHOP、GAPDH)4 ℃冰箱孵育過夜；TBST洗滌3次，每次10 min；分別加入1∶10 000稀釋的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，每次10 min。ECL顯色試劑盒顯色，UPV INC凝膠成像系統顯影，用Photoshop和Image J 進行光密度對比分析，以目的蛋白與GAPDH內參光密度比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 兩組Grp78、CHOP mRNA表達比較 與對照組比較，觀察組Grp78 mRNA相對表達量在Borax作用2 h達到最高，在作用3、4 h下降(F=29.233，P<0.01)；與對照組比較，觀察組CHOP mRNA相對表達量在Borax作用4 h內表達持續升高(F=208.207，P<0.01)。見表1。

表1 兩組HepG2細胞中Grp78、CHOP mRNA相對

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.2 兩組Grp78、CHOP蛋白表達比較 與對照組比較，觀察組Grp78蛋白相對表達量在Borax作用2 h內表達上調，在作用3、4 h下降(F=79.936，P<0.01)；與對照組比較，CHOP蛋白的相對表達量在Borax作用4 h內持續升高(F=200.324，P<0.01)。 見表2。

表2 兩組HepG2細胞中Grp78、CHOP蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

3 討論

HCC是惡性程度很高的腫瘤之一，嚴重危害人類健康，全世界每年超過50萬肝癌患者死亡，其發病率和病死率在惡性腫瘤中分別位居第5位和第3位[11,12]。由于藥物治療HCC的不良反應、耐藥機制等原因復雜多變，使HCC患者預后差。尋求新的抗HCC藥物及方法勢在必行。研究[11, 12]發現，ERS及其介導的細胞凋亡與肝癌的發生發展關系密切。一些通過激活ERS的抗HCC藥物已研制成功并用于臨床，例如索拉菲尼，抗癌效果顯著，已成為臨床一線抗HCC藥物。但是，近年來已有索拉非尼出現耐藥的報道。因此，從ERS層面探尋新的抗HCC藥物顯得尤為重要。

當缺氧、營養缺乏、能量不足、氧化應激、糖基化改變、鈣消耗或DNA損傷等不利因素存在時，可引起ERS，它是為了保護內質網正常生理功能而產生的主動防御信號。Grp78是內質網中的分子伴侶[13]，在參與ERS反應調節中發揮重要作用，現已認為是ERS發生的標志[14]。CHOP是Grp78蛋白下游重要的靶基因，還是介導內質網應激誘導細胞凋亡的重要成員之一。在無應激條件下，CHOP表達非常少；當ERS發生后，CHOP表達量會迅速升高。表達上調的CHOP可進一步促進腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)受體或下調Bcl-2的表達，并最終啟動細胞凋亡程序[15]。目前，在HCC細胞中，已發現ERS相關基因的表達。利用基因敲除技術敲除小鼠Grp78基因后，實驗證明該小鼠可表現出與年齡相關的非酒精性脂肪肝炎，并且在此小鼠肝組織中發現典型的脂肪變性、肝炎和纖維化，隨后逐漸演變成HCC[16]。在另一項試驗中，給予大鼠肝癌模型口服褪黑素，以此來觀察ERS在HCC中發揮的作用；結果發現，褪黑素可誘導肝癌細胞凋亡，并且Grp78和CHOP蛋白表達增加[17]。這些實驗表明，ERS蛋白Grp78和CHOP表達變化在HCC的發病機制中所起的重要作用。

為探討Borax使HepG2細胞發生了ERS反應這一現象，并最終通過ERS途徑誘導HepG2細胞發生凋亡，我們運用qRT-PCR和免疫印跡技術檢測Grp78 和CHOP mRNA及蛋白表達。本研究發現，0.1 mmol/L Borax作用于HepG2細胞1、2、3、4 h后Grp78 在mRNA及蛋白表達水平上表達一致，即在2 h內表達上升，在3、4 h表達下降，而CHOP隨著時間延長表達升高。這表明Borax在作用于HepG2細胞后，在短時間內發生了ERS反應，以此促使細胞恢復穩態；Borax作用于HepG2細胞后，隨著作用時間延長，促凋亡蛋白CHOP被激活，ERS反應逐漸減弱，細胞凋亡明顯。本研究結果表明，Borax作用于HepG2細胞可能通過活化ERS蛋白Grp78及上調促凋亡蛋白CHOP的表達，從而誘導細胞發生凋亡，使Borax具有成為抗肝癌藥物的潛質。這也為Borax有望成為抗癌候選藥物奠定了理論基礎，下一步我們將更深層次地探討Borax誘導肝癌細胞凋亡的機制。

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