電針通過抑制AQP4表達減輕局灶腦缺血/再灌注大鼠腦水腫損傷及星形膠質細胞激活*

卞煒，秦文熠（.重慶市永川區中醫院康復科4060；.重慶醫科大學附屬第一醫院中西醫結合科，重慶 40006）

腦水腫損傷是缺血性腦血管疾病潛在的一種嚴重并發癥[1]，而腦水腫是引發大面積腦梗死高死亡率和高致殘率的重要原因[2]。研究表明，水通道蛋白4（AQP4）是中樞神經系統最主要的水通道蛋白，廣泛存在于星形膠質細胞[3]，其在腦缺血所致腦水腫的發病機制中占據著重要地位[4]。星形膠質細胞作為中樞神經系統的主要支持成分，在腦缺血發生后，過度激活的星形膠質細胞可通過釋放谷氨酸[5]、促炎性細胞因子誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）等[6]分泌加重再灌注損傷。研究表明，AQP4不僅可介導星形膠質細胞調節水在腦、血管和腦室之間的交換，還參與了腦缺血發生后星形膠質細胞的激活[7-8]。針刺作為中國傳統的非藥物治療手段，對腦缺血/再灌注炎性損傷具有顯著的臨床效應[9]，但其抗炎機制尚不明確。本研究著重探討電針能否通過調節AQP4的表達減輕腦水腫及星形膠質細胞活化，以期深入探討電針治療減輕局灶腦缺血/再灌注后腦損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠60只，體重250～300 g，由重慶醫科大學動物中心[SCXK（渝）2012-0002]提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 AQP4多克隆抗體（Abcam公司）、神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體（Abcam公司）、免疫熒光定量PCR相關試劑（Takara公司）、AQP4、GFAP引物（上海生物生工有限公司合成）、G6850型電針治療儀（北京精工儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 將60只大鼠分為正常組（NC組）、模型組（tMCAO組）、模型+電針治療組（EA組）、模型+電針+AQP4特異性拮抗劑TGN-02組（TGN-02組），每組15只。采用改良線栓法[10-11]規范化制備大鼠右側大腦中動脈缺血/再灌注模型，缺血時間為90 min。TGN-02組大鼠于造模前腹腔注射AQP4特異性拮抗劑TGN-02，劑量為 200 mg/kg[12]。

1.2.2 電針刺激 EA組與TGN-02組參照中國針灸學會實驗針灸委員會實驗動物穴位圖譜，選取大鼠“百會”穴及左側“四關”穴為電針穴位，電針頻率為2/20 Hz，波型為疏密波，強度以大鼠肢體輕微震顫為宜。EA組與TGN-02組首次電針刺激于再灌注后1 h進行，刺激時間每次20 min，每天治療1次。

1.2.3 主要檢測指標及方法

1.2.3.1 腦組織含水量檢測 再灌注后24 h，采用干濕法測定腦組織含水量。準確稱取右側腦組織濕重，后置于100～110℃烤箱中烘干24 h以上至恒重，稱取腦干重。腦組織含水量百分比=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.3.2 Western blotting檢測AQP4蛋白的表達 取大腦皮質缺血區腦組織約50 mg入蛋白裂解液，充分勻漿后靜置半小時，4℃12 000 r/min離心15 min，取上清液。BCA蛋白定量法檢測上清液濃度。用4×上樣緩沖液將蛋白稀釋成相同濃度，-80℃保存。以50μg樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）電泳，然后轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉60 min，孵育 AQP4一抗（稀釋比例為 1∶2 000），4℃過夜，孵育二抗（稀釋比例為1∶5 000）1 h，ECL凝膠成像儀顯影，采用軟件Fusion進行灰度值分析。

1.2.3.3 實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測AQP4、GFAP mRNA的表達 按Takara說明書提取大鼠大腦缺血區皮質總RNA，后將總RNA逆轉錄為20μL cDNA。AQP4 mRNA 的上游引物 5′-AGATCAGCATCGCCAAGTCTCT-3′，下游引物為 5′-AGTGAGGTTCCAT-3′；GFAP mRNA 的上游引物 5′-AGTGGTATCGGTCCAAGTTTG-3′，下游引物為 5′-GTTGGCGATAAGTCATTAC-3′；β-actin mRNA 的上游引物 5′-ACGGTCAGGTACTCACTATCG-3′，下游引物為 5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′。

1.2.3.4 免疫熒光檢測GFAP的表達 將冰凍切片采用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X100）室溫孵育30 min，5%山羊血清 37℃封閉1 min，加GFAP一抗（稀釋比例 1∶100），4℃過夜，第 2天 37℃復溫 1 h，熒光二抗 37 ℃孵育 60 min，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）37℃孵育10 min，50%甘油封片。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件進行數據處理，所有數據以±s表示，采用One-Way ANOVA分析，多組間進一步比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦水腫情況比較 再灌注后24 h，tMCAO組大鼠出現明顯腦水腫，EA組腦水腫較tMCAO組明顯減輕，TGN-02組腦水腫較EA組明顯加重，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組腦水腫情況比較

2.2 各組大鼠大腦缺血皮質區AQP4蛋白及mRNA表達情況 Western blotting結果顯示，NC組有少量AQP4蛋白表達。tMCAO組和EA組AQP4蛋白表達均高于NC組，EA組AQP4表達明顯低于tMCAO組，TGN-02組AQP4表達明顯低于EA組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。RT-qPCR 結果顯示，AQP4 mRNA 表達規律與蛋白表達規律一致，NC組表達很弱，EA組較tMCAO 組明顯減少（P＜0.05），TGN-02處理后，AQP4 mRNA 水平進一步降低（P＜0.05）。見圖2、3。

圖2 各組SDS-PAGE電泳圖

圖3 各組AQP4蛋白及mRNA表達情況比較

2.3 各組大鼠大腦缺血皮質區GFAP mRNA表達情況 RT-qPCR結果顯示，tMCAO組GFAP mRNA表達較NC組明顯升高，EA組較tMCAO組明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）；阻斷APQ4作用后，電針治療未能下調 GFAP mRNA表達（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組GFAP mRNA表達情況比較

2.4 各組大鼠大腦缺血皮質區GFAP標記的星形膠質細胞比較 熒光共聚焦結果顯示，NC組星形膠質細胞突起細長，分支較少，tMCAO組星形膠質細胞胞體肥大、腫脹、突起增多。EA組星形膠質細胞數量較tMCAO組明顯減少。TGN-02作用被阻斷后，電針治療未能削弱星形膠質細胞活化。見圖5。

圖5 各組GFAP陽性星形膠質細胞活化情況（400×）

3 討 論

在中樞神經系統中表達的幾個水通道中，AQP4被認為是治療腦腫瘤、創傷性腦損傷、腦積水和神經炎癥等腦部疾病的一個很有治療前景的靶點[13-16]。AQP4不僅是腦內一種特異性的水轉運孔道，還參與維持腦內微環境、調節神經傳導、誘導神經再生和自身免疫的應答等病理生理反應。

腦內與毛細血管、蛛網膜和軟腦膜直接接觸的星形膠質細胞所組成的膠質界膜的致密星形足突是AQP4的主要表達區域[17-18]。血管周圍的星形細胞足突是AQP4高表達的區域[19-20]。研究表明，AQP4參與了星形膠質細胞調節腦、血管和腦室之間水的交換及腦缺血發生后星形膠質細胞的激活。MANLEY等[21]發現，AQP4基因敲除小鼠較野生型小鼠行tMCAO術后存活率高，且AQP4基因敲除的小鼠星形膠質細胞周圍毛細血管腫脹程度及腦水腫與野生型小鼠相比明顯減輕。THRANE等[22]研究顯示，AQP4的缺失可減弱星形膠質細胞鈣離子信號，從而減弱AQP4表達增高誘導的星形膠質細胞腫脹、活化。AQP4基因敲除小鼠的星形膠質細胞的增殖、再激活和膠質瘢痕形成受到明顯抑制[8]，過表達AQP4可促進細胞黏附、新的屏障和膠質界膜形成[9]。

研究表明，電針治療可下調腦缺血/再灌注損傷后腦內AQP4表達。任清瀟等[23]發現，再灌注后24 h，電針可下調因腦缺血而誘導的AQP4表達升高，且血管周邊AQP4分布減少。有研究表明，電針治療能明顯減輕血-腦屏障的破壞，減輕腦水腫，減少IgG外滲，降低AQP4和金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達，且AQP4和MMP-9的變化有顯著相關性，推測電針對腦再灌注后血-腦屏障損傷的保護作用可能與其調節AQP4表達有關[24-25]。陳春芳等[26]也有相同的發現。盡管大量研究表明，電針治療可下調AQP4表達，減輕腦水腫，但電針治療減輕腦水腫的機制是否與下調AQP4相關？還是這僅是一種腦缺血后的伴隨現象？在目前的研究中尚無定論，基于此，本研究采用腹腔注射TGN-02特異性阻斷AQP4表達，觀察電針治療后腦水腫情況是否同單純電針治療組一樣得到改善。結果表明，AQP4作用被阻斷后，電針治療減輕腦水腫的作用明顯減弱，從而證實了電針確實可以通過調節AQP4表達，減輕腦水腫。在證實電針可以通過下調AQP4表達減輕腦水腫損傷后，本課題進一步探討，該作用是否與減輕星形膠質細胞的活化有關，結果發現，當阻斷AQP4作用后，電針治療并不能明顯削弱星形膠質細胞的活化，表明了電針治療減輕腦缺血誘導的星形膠質細胞的活化與其下調AQP4有關。

本研究從電針減輕腦缺血/再灌注后腦水腫為切入點，特色之處在于采用腹腔注射AQP4抑制劑，觀察腦水腫改善情況，并同時檢測腦內星形膠質細胞的活化情況。研究結果表明，電針可通過下調AQP4表達，減輕腦水腫和腦缺血誘導的星形膠質細胞的活化，為電針在臨床上治療腦梗死提供了進一步的理論依據。

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