經(jīng)抗菌素修飾的Brindley電極體外抗菌活性的可行性研究

唐發(fā)兵，徐瑞生

(1.三臺(tái)縣人民醫(yī)院，四川 綿陽(yáng) 621100；2.無(wú)錫市第三人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214000)

Brindley技術(shù)是重建脊髓損傷后膀胱功能障礙較為成熟的一種方法，它是英國(guó)學(xué)者Brindley通過(guò)大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研發(fā)的具有自主控制性排尿的臨床技術(shù)，到目前為止全球已超過(guò)3 000例患者應(yīng)用其幫助排尿，其文獻(xiàn)報(bào)道的臨床效果也令人鼓舞[1-8]。在目前神經(jīng)干細(xì)胞技術(shù)還未應(yīng)用于臨床之前，該技術(shù)可作為治療骶上脊髓損傷后尿失禁的首選方法。其中Brindley電極是Brindley技術(shù)的核心組成部分，其失敗的主要原因是電極本身的實(shí)效及電極被細(xì)菌黏附后出現(xiàn)感染。通常電極的失敗可通過(guò)系統(tǒng)檢查得以修復(fù)；但電極感染后必須取出電極，才能控制感染，其原因是植入物與周?chē)慕Y(jié)締組織或纖維組織之間常會(huì)形成潛在腔隙，它允許細(xì)菌在其中自由移動(dòng)，而抗生素和身體防御因子卻很難滲透進(jìn)去[9]。為了預(yù)防感染，經(jīng)典的方法是在電極外硅橡膠絕緣體上涂上少許抗生素，但其抗菌活性只能維持較短時(shí)間[9]。鑒于此筆者設(shè)計(jì)了經(jīng)抗菌素修飾的Brindley電極，并初步探討其抗菌活性。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)器材：Bringdley電極外層絕緣硅橡膠套(由英國(guó)XX公司提供)；測(cè)試菌種：大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株8 099、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC12228(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)；氯仿(由無(wú)錫市藥品采購(gòu)站提供)；醫(yī)用恒溫箱；利福平、克林霉素、三氯生、夫西地酸鈉，MH培養(yǎng)皿。

1.2抗菌素修飾的硅橡膠的制作過(guò)程：①選擇的抗菌素分別是利福平、克林霉素和三氯生，把三者溶于有機(jī)溶劑氯仿中，分別得到濃度(W/V)為0.2%、1%、1%。把硅橡膠片放在上述溶液中，時(shí)間設(shè)定為1 h、溫度為37℃，即待硅膠片膨脹到原始兩倍大時(shí)取出，用75%乙醇輕沖洗，去除其殘留的氯仿，風(fēng)干，直到其恢復(fù)原來(lái)大小。將其放入試管中，用高壓蒸汽滅菌(W121℃；T 15 min)。②在無(wú)菌條件下，將4.5 g夫西地酸鈉粉劑放入經(jīng)滅菌的10 ml液態(tài)硅膠中，均勻攪拌后，均勻涂在滅菌后的硅膠片上。

1.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程：實(shí)驗(yàn)分成兩組，分別為試驗(yàn)組：含有利福平-克林霉素-三氯生的硅橡膠片9片；對(duì)照組：用涂抹方法含有鹽酸夫西地酸鈉的硅橡膠片9片。分別取兩組用于實(shí)驗(yàn)的硅橡膠片各一片，放于接種了實(shí)驗(yàn)菌株(濃度為106cfu/ml)的MH瓊脂板上，再把瓊脂板放于恒溫箱中時(shí)間設(shè)定為24 h，T37℃，24 h后取出培養(yǎng)皿，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈(抑菌圈直徑減去硅橡膠本身直徑)大小。再把其硅橡膠片移到另一接種了相同菌株的瓊脂板上，但要確保同一面接觸瓊脂。重復(fù)上述操作，直到實(shí)驗(yàn)終止。

2 結(jié)果

當(dāng)以大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象時(shí)，在第1個(gè)10天，試驗(yàn)組抑菌圈大小為(22.21±0.75)mm，對(duì)照組為(6.10±2.60)mm，兩組的抑菌效應(yīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在接下來(lái)的20天，對(duì)照組未顯示出抑菌效應(yīng)，兩組不具有可比性；當(dāng)以表皮葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象時(shí)，在3個(gè)時(shí)間段，試驗(yàn)組與對(duì)照組的抑菌效應(yīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。兩組對(duì)不同細(xì)菌的抑菌效果，見(jiàn)圖1。

組別大腸桿菌 第10天 第20天 第30天 表皮葡萄球菌 第10天 第20天 第30天 試驗(yàn)組22.21±0.75--51.60±1.6648.55±2.4946.30±1.62對(duì)照組6.10±2.60--46.55±2.0040.80±2.1436.10±1.37P值<0.05<0.05<0.05<0.05

圖1 兩組對(duì)不同細(xì)菌的抑菌效果圖示

3 討論

在外科領(lǐng)域中，預(yù)防植入體內(nèi)管道感染常用措施是：圍手術(shù)期常規(guī)應(yīng)用頭孢類(lèi)抗生素和在植入物表面涂一層抗生素。但這些措施作用時(shí)間相對(duì)較短或?qū)植拷M織有刺激作用。考慮到這些Van Noort R等[10-12]最先介紹了對(duì)于硅橡膠材質(zhì)的引流管采用侵漬法，以氯仿作為膨脹劑，讓抗菌素能通過(guò)彌散進(jìn)入硅橡膠內(nèi)部微孔，以達(dá)到植入體內(nèi)后期緩慢釋放效應(yīng)，且硅橡膠本身機(jī)械性能并未明顯改善，目前的臨床結(jié)果也證實(shí)是有效的[13-15]。而對(duì)于本實(shí)驗(yàn)需明確以下三個(gè)問(wèn)題：

3.1關(guān)于Brindley電極：Brindley電極是由外層的硅橡膠和內(nèi)層的線圈組成，為了提高絕緣性能，線圈上涂有一層聚乙烯漆。考慮到如以電極整體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在測(cè)試其經(jīng)抗菌素修飾后的抗菌活性較困難，所以為了方便體外測(cè)試其抗菌活性，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，把外層硅橡膠單獨(dú)取下，將把其制作成厚0.45 mm，直徑為4.8 mm的硅橡膠片。

3.2關(guān)于實(shí)驗(yàn)菌種的選擇：盡管目前為止全世界還沒(méi)有文獻(xiàn)系統(tǒng)報(bào)道Brindley電刺激術(shù)后感染菌種來(lái)源，但可以借鑒神經(jīng)外科安放腦室分流管術(shù)后感染的經(jīng)驗(yàn)。據(jù)Bayston，R[11]等報(bào)道幾乎所有感染發(fā)生在管道插入過(guò)程中，而且細(xì)菌主要是來(lái)自皮膚的表皮葡萄球菌，考慮到Bringley手術(shù)傷口接近會(huì)陰部。筆者推測(cè)Bringley電極感染主要是以大腸桿菌為主的革蘭陰性菌和以表皮葡萄球菌為代表的凝血酶陰性的葡萄球菌。

3.3關(guān)于實(shí)驗(yàn)抗菌素的選擇：在選擇有效抗生素時(shí)除需考慮到一般原則如藥物的抗菌譜、藥物毒理學(xué)；還應(yīng)重點(diǎn)考察藥物在硅橡膠中的彌散特性能，基于此氨基糖苷類(lèi)和糖肽類(lèi)就不在考慮之列。現(xiàn)有的體外實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用已證實(shí)利福平和鹽酸克林霉素兩者組合較其他抗生素單用或其他組合具有明顯優(yōu)勢(shì)[16-18]。為了擴(kuò)大抗菌譜筆者還選擇了三氯生，它是一種外用高效抗菌消毒劑，它可以殺滅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細(xì)菌及白色念珠菌等真菌；其殺菌機(jī)理是：先吸附于細(xì)菌細(xì)胞壁上，進(jìn)而穿透細(xì)胞壁，與細(xì)胞質(zhì)中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而殺死細(xì)菌。筆者在觀察單一抗菌素處理的硅橡膠片時(shí)發(fā)現(xiàn)了耐藥菌種的出現(xiàn)，當(dāng)然是在排除了細(xì)菌污染。如表皮葡萄球菌對(duì)于含有利福平的硅橡膠片在9天內(nèi)就能看見(jiàn)耐藥菌出現(xiàn)。避免耐藥菌種的出現(xiàn)，筆者采用三者藥物的聯(lián)合方法。因?yàn)檫@樣至少有兩種藥物在發(fā)揮作用。其原因可用雙藥物原則進(jìn)行闡述。Zhiao X等[19]報(bào)道兩種藥物應(yīng)用時(shí)，如果細(xì)菌存活，它必須在相隔甚遠(yuǎn)的兩個(gè)基因組中同時(shí)發(fā)生兩個(gè)基因的突變， 而這種事件發(fā)生的幾率是十分低的。本實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明了這一點(diǎn)，見(jiàn)圖1，雖然試驗(yàn)組的抑菌效應(yīng)始終處于起伏變化中，但抑菌效應(yīng)無(wú)明顯下降，而對(duì)于對(duì)照組而言，其抑菌效應(yīng)基本是處于持續(xù)減弱，直到實(shí)驗(yàn)終止。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)態(tài)地觀察抗菌劑對(duì)每種靶細(xì)菌的抗菌持續(xù)時(shí)間，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出試驗(yàn)組抗菌活性明顯優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。筆者認(rèn)為其優(yōu)勢(shì)在于：首先，進(jìn)入硅橡膠內(nèi)的抗菌素能從微孔中恒定地釋放出來(lái)，達(dá)到長(zhǎng)期抗菌活性，直到其抗菌素量小于細(xì)菌的MIC；其次，抗生素并非與軟組織相接觸，不會(huì)被組織液帶入血液，從而降低局部抗菌素計(jì)量；最后，雙藥物原則在本實(shí)驗(yàn)也發(fā)揮得淋漓盡致。但這一結(jié)果除了與抗菌劑本身抗菌活性影響外，還受藥物分子在瓊脂板上彌散性能的影響。在抗菌譜一致的情況下，彌散性能強(qiáng)的分子，在瓊脂板上抑菌圈的范圍必定較大。

本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于，通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)并不能得出體外這種靜態(tài)下觀察到的結(jié)果與體內(nèi)的結(jié)果會(huì)一直。雖然Bassetti S等[20]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)體外抑菌區(qū)的大小可作為一個(gè)有用的篩選試驗(yàn)評(píng)價(jià)新的抗感染涂料的抗菌活性。

[1] Brindley G S.The first 500 patients with sacral anterior root stimulator implants：general description[J].Paraplegia，1994，32(12):795.

[2] Barat M，Egon G，Daverat P，et al.Electrostimulation of anterior sacral nerve roots in the treatment of central neurogenic bladders.G.S.Brindley′s technique.Results of the 40 first French cases[J].Journal Durologie，1993，99(1):3.

[3] Egon G,Barat M,Colombel P,et al.Implantation of anterior sacral root stimulators combined with posterior sacral rhizotomy in spinal cord injury patients[J].World J Urol,1998,16(5):342.

[4] Schurch，Knapp，Jeanmonod，et al.Does sacral posterior rhizotomy suppress autonomic hyper‐reflexia in patients with spinal cord injury?[J].British Journal of Urology，1998，81(1):73.

[5] Bauchet L，Segnarbieux F，Martinazzo G，et al.Neurosurgical treatment of hyperactive bladder in spinal cord injury patients[J].Neurochirurgie，2001，47(1):13.

[6] Bauchet L，Segnarbieux F，Martinazzo G，et al.Neurosurgical treatment of hyperactive bladder in spinal cord injury patients[J].Neurochirurgie，2001，47(1):13.

[7] Kutzenberger J.Surgical therapy of neurogenic detrusor overactivity (hyperreflexia) in paraplegic patients by sacral deafferentation and implant driven micturition by sacral anterior root stimulation：methods，indications，results，complications，and future prospects[J].Acta Neurochirurgica Supplement，2007，97(Pt 1):333.

[8] Kutzenberger J，Domurath B，Sauerwein D.Spastic Bladder and Spinal Cord Injury：Seventeen Years of Experience with Sacral Deafferentation and Implantation of an Anterior Root Stimulator[J].Journal of Urology，2006，175(3):239.

[9] Rushton D N，Brindley G S，Polkey C E，et al.Implant infections and antibiotic-impregnated silicone rubber coating[J].Journal of Neurology Neurosurgery & Psychiatry，1989，52(2):223.

[10] Bayston R，Grove N，Siegel J，et al.Prevention of hydrocephalus shunt catheter colonisation in vitro by impregnation with antimicrobials[J].Journal of Neurology Neurosurgery & Psychiatry，1989，52(5):605.

[11] Bayston R，Lari J.A Study of the Sources of Infection in Colonised Shunts[J].Developmental Medicine & Child Neurology，1974，16(6 Suppl 32):16.

[12] Van N R，Bayston R.Mechanical properties of antibacterial silicone rubber for hydrocephalus shunts.[J].Journal of Biomedical Materials Research，1979，13(4):623.

[13] Eymann R，Chehab S，Strowitzki M，et al.Clinical and economic consequences of antibiotic-impregnated cerebrospinal fluid shunt catheters[J].Journal of Neurosurgery Pediatrics，2008，1(6):444.

[14] Zabramski J M，Whiting D，Darouiche R O，et al.Efficacy of antimicrobial-impregnated external ventricular drain catheters：a prospective，randomized，controlled trial[J].Journal of Neurosurgery，2003，98(4):725.

[15] Govender S T，Nathoo N，van Dellen J R.Evaluation of an antibiotic-impregnated shunt system for the treatment of hydrocephalus[J].Journal of Neurosurgery，2003，99(5):831.

[16] Bayston R，Grove N，Siegel J，et al.Prevention of hydrocephalus shunt catheter colonisation in vitro by impregnation with antimicrobials[J].Journal of Neurology Neurosurgery & Psychiatry，1989，52(5):605.

[17] Pattavilakom A，Xenos C，Bradfield O，et al.Reduction in shunt infection using antibiotic impregnated CSF shunt catheters：an Australian prospective study[J].Journal of Clinical Neuroscience，2007，14(6):526.

[18] Bayston R，Ashraf W，Bhundia C.Mode of action of an antimicrobial biomaterial for use in hydrocephalus shunts[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2004，53(5):778.

[19] Zhao X，Drlica K.Restricting the Selection of Antibiotic-Resistant Mutants：A General Strategy Derived from Fluoroquinolone Studies[J].Clinical Infectious Diseases An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America，2001，33 (Suppl 3):S147.

[20] Bassetti S，Hu J，Jr D R，et al.In vitro zones of inhibition of coated vascular catheters predict efficacy in preventing catheter infection with Staphylococcus aureus in vivo[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2000，19(8):612.