液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定涼皮湯料中罌粟堿含量

劉新才，宗萬(wàn)里，魯 剛

(威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 威海264209)

罌粟堿([1-(3，4-二甲氧基苯基)甲基]-6，7-二甲氧基異喹啉)是自然界中存在的一種重要的芐基異喹啉類(lèi)生物堿，在阿片類(lèi)植物，如罌粟的殼和籽中含量較高.罌粟殼是罌粟科植物的干燥成熟果殼，主要生物活性成分為嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿和那可汀等，具有斂肺、澀腸和止痛等功能，被用于治療久咳、久瀉、脫肛和脘腹疼痛等疾病，但久服易成癮.由于罌粟殼的易成癮性，國(guó)內(nèi)有些不法商販將其作為食品添加劑加入到食品中，例如火鍋底料、方便面調(diào)料、涼皮湯料等，以吸引顧客.因此國(guó)家有必要通過(guò)檢測(cè)罌粟殼中含有的罌粟堿成分以實(shí)現(xiàn)對(duì)罌粟殼使用情況的監(jiān)督.檢測(cè)食品中罌粟堿含量的方法主要有氣相色譜法[1，2]、氣質(zhì)聯(lián)用法[3]、液相色譜法[4-7]、ELISA法[8，9]、液質(zhì)聯(lián)用法[10].本文建立了使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)涼皮湯料中罌粟堿含量的檢測(cè)方法，該方法測(cè)量準(zhǔn)確，樣品前處理簡(jiǎn)單，適用于在時(shí)限要求較高的情況下，實(shí)驗(yàn)室大批量的樣品檢測(cè).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Ultimate 3000型高效液相色譜儀；Thermo fisher TSQ QUANTUM ULTRA三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器(配電噴霧離子源ESI)； HILIC液相色譜柱(2.1 mm ×150 mm，3.5 μm，XBridge)，沃特世公司；0.22 μm有機(jī)相針管濾頭，Agela 公司；漩渦振蕩器(MS3 Digital)，IKA公司；高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 23R)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；純水機(jī)(Milli-Q Direct8)，密理博公司；電子天平(JY10002)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司.

乙腈：色譜純，默克公司；甲酸：≥98%，Sigma-Aldrich公司；甲酸銨:≥99%，for HPLC，Shanghai Macklin Biochemical Co.，Ltd；罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):10 μg/mL，天津阿爾塔有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨水溶液的制備方法：稱(chēng)取0.63 g甲酸銨溶于1 L水中，加入1 mL甲酸，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾.

1.2 儀器條件

1.2.1 液相色譜條件

HILIC液相色譜柱：2.1 mm×150 mm(i，d)，3.5 μm；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1所示.

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.2.2 質(zhì)譜參考條件

(1)電離方式：電噴霧電離，正離子掃描模式；

(2)噴霧電壓：3.5 kV(正模式)；

(3)蒸發(fā)器溫度：常溫；

(4)鞘氣(N2)壓力：35 arb；

(5)輔助氣(N2)流量：10 arb；

(6)碰撞室(氬氣)壓力：1.5 mTorr；

(7)離子傳輸毛細(xì)管溫度：350 ℃；

(8)掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)；

(9)質(zhì)譜divert valve狀態(tài)：0～3 min時(shí)處于InjectWaste狀態(tài)，3～6 min時(shí)處于LoadDetector狀態(tài)，6～15 min時(shí)處于InjectWaste狀態(tài)；

(10)碰撞能量如表2所示.

表2 罌粟堿的離子碎片及碰撞能量

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確吸取0.5 mL罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)溶液至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為1 μg/mL的罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)溶液.

首先從1 μg/mL的罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)溶液中，分別吸取20.0，40.0，80.0，100.0，200.0 μL，加入到5個(gè)含有1.0 g罌粟堿空白樣品的50 mL刻度離心管中，然后往每個(gè)刻度離心管中分別加入乙腈至10 mL，渦旋混合器提取1 min，經(jīng)高速離心機(jī)以8 000 rpm/min離心5 min，得到濃度分別為2，4，8，10.0，20.0 ng/mL的含有罌粟堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別取10 μL每個(gè)質(zhì)量濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，利用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).

1.4 樣品前處理

稱(chēng)取1.00 g(精確至0.01 g)涼皮湯料樣品于50 mL刻度離心管中，加入乙腈至10 mL，渦旋混合器提取2 min，經(jīng)高速離心機(jī)以8 000 rpm/min離心5 min，取清液用0.22 μm的針頭濾膜過(guò)濾后注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

罌粟堿能夠溶解在乙腈中，乙腈對(duì)樣品中的蛋白具有一定的沉淀作用，而且油脂不溶于乙腈.使用乙腈對(duì)樣品中的罌粟堿進(jìn)行提取，經(jīng)過(guò)高速離心機(jī)離心后，得到澄清的上層溶液，上層溶液能夠較為容易地通過(guò)0.22 μm的有機(jī)濾膜.樣品處理液中乙腈與水的比例接近9：1，與流動(dòng)相中有機(jī)相與水相的初始比例一致.

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

本文采用HILIC色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，在梯度洗脫的條件下對(duì)罌粟堿進(jìn)行分離洗脫，罌粟堿在HILIC柱上有較好的保留，且保留時(shí)間在4.4 min左右.在質(zhì)譜條件方面，利用質(zhì)譜檢測(cè)器自身所具有的方法優(yōu)化功能，首先選出罌粟堿的三個(gè)豐度最強(qiáng)的子離子，然后選取其中豐度最強(qiáng)的子離子設(shè)為定量離子，其余兩個(gè)設(shè)為定性參考離子，最后利用儀器所帶軟件優(yōu)化出每個(gè)離子對(duì)的最佳碰撞能量，最佳碰撞能量如表2所示.

2.3 色譜圖

在1.2的色譜及質(zhì)譜條件下，分別得到罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品在SRM方式下的總離子流圖、空白樣品的總離子流圖和加標(biāo)空白樣品的總離子流圖，如圖1、2、3所示.加標(biāo)樣品譜圖無(wú)干擾，在該色譜條件下，色譜結(jié)果良好.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品在SRM方式下的總離子流圖

圖2 未知樣品SRM方式下的TIC色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和最低檢出限

在以上實(shí)驗(yàn)條件下，以標(biāo)準(zhǔn)物峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性方程，再以基線(xiàn)噪聲10倍峰面積對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限(S/N=10)[11]，回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限如表3所示.

圖3 加標(biāo)未知樣品SRM方式下的TIC色譜圖

目標(biāo)物測(cè)定濃度范圍/(ng/mL)線(xiàn)性回歸方程相關(guān)系數(shù)定量限/(μg/kg)罌粟堿2～20y=157476x+1144040.99751.25

2.5 精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取不含罌粟堿的涼皮湯料空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別向1 g不同樣品中添加1 μg/mL罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)溶液20，100，200 μL，即樣品中罌粟堿含量為分別為20，100，200 μg/kg.按上述1.3.2樣品處理方法進(jìn)行樣品處理，每個(gè)濃度水平做6次平行處理.按1.2色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，精密度、回收率計(jì)算結(jié)果如表4所示.可以看出，采用本方法所得數(shù)據(jù)能夠滿(mǎn)足檢測(cè)要求.

表4 樣品添加回收和精密度實(shí)驗(yàn) (n=6)

2.6 未知樣品測(cè)定

利用液相色譜-吊聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法對(duì)市售的8份購(gòu)自不同商販的涼皮湯料中罌粟堿含量進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出罌粟堿.

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立了涼皮湯料中罌粟堿含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法.樣品經(jīng)過(guò)乙腈處理，離心后取上清液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)樣品空白基質(zhì)加標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法對(duì)回收率以及在電噴霧離子源上可能產(chǎn)生的樣品基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正，利用質(zhì)譜儀自帶的divert valve分流閥分流流動(dòng)相以降低對(duì)離子源以及質(zhì)譜檢測(cè)器的污染.該方法精密度及加標(biāo)回收率均滿(mǎn)足要求，前處理簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定，適合實(shí)驗(yàn)室大批量樣品的快速檢測(cè).

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